Evaluación de espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría triestímulo y análisis de imagen como herramientas para la determinación de carotenoides en ahuyama

Abstract

This thesis presents prediction models of total and specific carotenoid compounds in squash/pumpkin samples made from the combination of FTIR-ATR spectroscopy, colorimetry and image analysis with multivariate statistical analysis. To achieve this, we worked in two stages: in the first stage, 63 squash from eight different cultivars were processed in such a way that three types of sample were obtained, each with a different degree of isolation of the analyte (carotenoid compounds): (A) homogenized with a blender, (B) freeze-dried, and (C) extracts in hexane: acetone. From different experiments carried out with (A), (B) and (C) it was possible to obtain a series of data matrices obtained with spectroscopic techniques: L*a*b* coordinates by means of tristimulus colorimetry in CIELAB space, spectra absorbances in the middle infrared (400 - 4000 cm-1) by means of FTIR-ATR, and RGB values by means of digital image analysis, which were correlated with the total carotenoid content determined by UV-Vis spectrophotometry, by means of partial least squares (PLS) algorithm. In a second stage, 25 squashes/pumpkins from four cultivars from Palmira (Valle del Cauca) were processed in the same way to obtain the three types of sample with different degrees of isolation of the analyte: (A) (B) and (C), and also were obtained the data matrices of colorimetric coordinates, FTIR-ATR spectra and RGB values, which by means of PLS were correlated with the content of specific carotenoids determined by liquid chromatography with diode array (HPLC-DAD). In the first stage, when developing the correlation models between the total carotenoid content and the spectroscopic variables, it was found that, when using the absorbances of the FTIR-ATR in the region 920-3000 cm-1 as a predictor matrix, the goodness of fit of the model was quite high (R2PRED = 0.93), only when working with lyophilized samples (B), since for the homogenized samples (A) and the extracts (C) very low coefficients of determination were obtained (0.66 and 0.30, respectively) and therefore the models in these cases were not reliable. When modifying the predictor matrix by combining the FTIR-ATR data with color data or RGB image data, the models did not improve substantially. In the second stage, chromatographic analysis revealed that the predominant carotenoids in these samples were lutein and β-carotene, followed by violaxanthin and α-carotene. By developing the correlation models between the infrared data and the composition data, it was possible to obtain models with good prediction ability only for lutein (R2PRED = 0.94), the carotenoid present in the highest concentration in the studied samples. By including tristimulus colorimetry data in the predictor matrix, the results for lutein were maintained, and an improvement in the prediction coefficients for β-carotene was achieved (R2PRED = 0.91). In this case, the models for α-carotene and violaxanthin (minority carotenoids) maintained a very low goodness of fit, for which it is inferred that, by mixing the spectroscopic and colorimetric information, acceptable results are not achieved when the carotenoid compounds are not present in all the samples studied or are found in low concentrations. Finally, when modifying the predictor matrix and including infrared data with RGB image data, the models did not improve, presenting underfitting problems, which suggests that the inclusion of RGB data negatively alters the behavior of the PLS models. In general, of the three techniques studied, the one with the best predictive ability is FTIR-ATR spectroscopy for the case of determination of total carotenoids (R2PRED = 0.93), and FTIR-ATR spectroscopy combined with tristimulus colorimetry for the case of specific carotenoids, with a good predictive ability for the two predominant carotenoids: lutein (R2PRED = 0.94) and β-carotene (R2PRED = 0.91). It is noteworthy that, compared to conventional analysis techniques, the use of methods based on the combination of spectroscopic techniques and multivariate statistical analysis, would significantly decrease analysis times and the use of organic solvents. It can be concluded that these techniques are promising for the evaluation of the quality and the description of the presence of bioactive compounds in this and other vegetables.

Esta tesis presenta modelos de predicción de compuestos carotenoides totales y específicos en muestras de ahuyama realizados a partir de la combinación de espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría y análisis de imagen con análisis estadístico multivariado. Para lograrlo, se trabajó en dos etapas: en una primera etapa 63 ahuyamas de ocho cultivares distintos, fueron procesadas de tal forma que se obtuvieron tres tipos de muestra, cada una de estas con diferente grado de aislamiento del analito (compuestos carotenoides): (A) homogenizadas con licuadora, (B) liofilizadas, y (C) extractos en hexano:acetona. A partir de diferentes experimentos realizados con (A), (B) y (C) fue posible obtener una serie de matrices de datos obtenidos con técnicas espectroscópicas: coordenadas L*a*b* por medio de colorimetría triestímulo en el espacio CIELAB, espectros de absorbancias en el infrarrojo medio (400 – 4000 cm-1) por medio de FTIR-ATR y valores RGB por medio de análisis de imagen digital, que mediante algoritmo de mínimos cuadrados parciales (PLS) se correlacionaron con el contenido de carotenoides totales determinados por espectrofotometría UV-Vis. En una segunda etapa, 25 ahuyamas de cuatro cultivares provenientes de Palmira (Valle del Cauca) fueron procesadas de igual forma para obtener los tres tipos de muestra con diferente grado de aislamiento del analito: (A) (B) y (C), así como las matrices de datos de coordenadas colorimétricas, espectros de FTIR-ATR y valores RGB, las cuales mediante PLS se correlacionaron con el contenido de carotenoides específicos determinados por cromatografía líquida con arreglo de diodos (HPLC-DAD). En la primera etapa, al desarrollar los modelos de correlación entre el contenido de carotenoides totales y las variables espectroscópicas se encontró que, al emplear las absorbancias del FTIR-ATR en la región 920-3000 cm-1 como matriz predictora, la bondad de ajuste del modelo fue bastante alta (R2PRED=0,93), únicamente cuando se trabajó con muestras liofilizadas (B), dado que para las muestras homogenizadas (A) y los extractos (C) se obtuvieron coeficientes de determinación muy bajos (0,66 y 0,30, respectivamente) y por ende los modelos en estos casos no fueron confiables. Al modificar la matriz predictora combinando los datos de FTIR-ATR con datos de color o con datos de imagen RGB los modelos no mejoraron sustancialmente. En la segunda etapa, el análisis cromatográfico reveló que los carotenoides predominantes en estas muestras fueron luteína y β-caroteno, seguidos de violaxantina y α-caroteno. Al desarrollar los modelos de correlación entre los datos de infrarrojo y los datos de composición, fue posible obtener modelos con buena capacidad de predicción solo para la luteína (R2PRED=0,94), el carotenoide presente en mayor concentración en las muestras estudiadas. Al incluir en la matriz predictora los datos de colorimetría triestímulo, se mantuvieron los resultados para la luteína, y se logró una mejora en los coeficientes de predicción para el β-caroteno (R2PRED=0,91). En este caso, los modelos para el α-caroteno y la violaxantina (carotenoides minoritarios) mantuvieron una bondad de ajuste muy baja, por lo cual se infiere que, al mezclar la información espectroscópica y colorimétrica, no se logran resultados aceptables cuando los compuestos carotenoides no están presentes en todas las muestras estudiadas o se encuentran en bajas concentraciones. Finalmente, al modificar la matriz predictora e incluir datos de infrarrojo con datos de imagen RGB, los modelos no mejoraron, presentando problemas de subajuste, lo cual sugiere que la inclusión de datos RGB altera negativamente el comportamiento de los modelos PLS. En general, de las tres técnicas estudiadas, la que mejor presentó capacidad predictiva es la espectroscopía FTIR-ATR para el caso de determinación de carotenoides totales (R2PRED=0,93), y la espectroscopía FTIR-ATR combinada con colorimetría triestímulo para el caso de carotenoides específicos, con buena capacidad predictiva de los dos carotenoides predominantes: luteína (R2PRED=0,94) y β-caroteno (R2PRED=0,91). Es de resaltar que, en comparación con las técnicas de análisis convencional, el uso de métodos basados en la combinación de técnicas espectroscópicas y análisis estadístico multivariado, disminuirían notablemente los tiempos de análisis y el empleo de solventes orgánicos. Se puede concluir que estas técnicas son promisorias para la evaluación de la calidad y la descripción de la presencia de compuestos bioactivos en esta y otras hortalizas.