Evaluación del uso de mezclas de polímeros para el desarrollo de micro/nanofibras con incorporación de un péptido antimicrobiano

Abstract

Currently, food losses are generated due to the presence of spoilage microorganisms, therefore the use of active packaging that functions as a protective barrier is necessary. To produce this type of packaging, it has been recently proposed the use of ultrafine membranes incorporated with antimicrobial compounds that potentially serve as attachments in active packaging and favor the controlled release of the compound. Peptides are one of the most commonly incorporated antimicrobials, having a demonstrated antimicrobial activity against a wide spectrum of microorganisms. Meanwhile, the membranes can be made from biodegradable polymers by taking advantages of nanotechnologies, the electrospinning technique being of particular interest. Despite the advantages of the use of biopolymers for the manufacture of ultra-thin membranes as a devices for active packaging, they often have undesirable characteristics, especially low resistance to water, which compromises their structural stability for this type of application. An improvement alternative consists in the combination of polymers of different nature that improve the properties of interaction with water of ultra-thin membranes, without compromising their biodegradability and biocompatibility. In this study, ultrafine membranes were developed using electrospinning from a polymer mixture for the incorporation of the palindromic peptide LfcinB(21-25)Pal, synthesized from bovine lactoferrin, which has been shown to have antimicrobial activity against viruses, bacteria, and fungi. Firstly, the feasibility of producing membranes of pullulan (PUL) a highly hydrophilic polysaccharide, polycaprolactone (PCL) a hydrophobic biodegradable polyester, and PCL mixtures with poorly water-soluble polysaccharides (modified starch of potato and β-glucan).The membranes were morphologically characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM) to observe the orientation of the fiber, its diameter, and the presence of imperfections. The structural characteristics were evaluated by Differential Scanning Calorimetry (DSC) to determine fiber crystallinity. Chemical characteristics were evaluated by infrared spectroscopy (FTIR-ATR) to evaluate the presence of characteristic functional groups for each fiber. As a final point, the wettability was evaluated by measuring the contact angle.

Multilayer membranes (PCL-PUL-PCL) have structural characteristics of cylindrical and smooth fibers, with an approximate diameter of 100 nm and thermal stability at XI temperatures between 200oC and 300oC. The FTIR spectra of the membranes confirmed electrospinning did not generate modifications in the structure of polymers. Based on the above, these membranes were chosen for peptide encapsulation, PUL was used as an encapsulation agent for the peptide and PCL was used to coat PUL since the highly hydrophobic character of PCL which maintained the integrity of the membrane in the presence of water.

Subsequently, it was possible to encapsulate up to 65% of the LfcinB (21-25)Pal within the PUL fibers at a maximum load of 50 mg peptide/g of PUL, to then coat them with PCL. The membranes were characterized by structural, physical, and morphological properties. FTIR analysis showed that there were no chemical changes in polymers or peptide after electrospinning. The evaluation of antioxidant activity by DPPH showed that membranes at the highest load of the peptide possess an antiradical activity of 5.21 x 10-4mg ± 1.12 x 10-5 of gallic acid/mg membrane. Finally, in previous studies carried out by the research group, it was found that the Minimum Inhibitory Concentration of the peptide, when encapsulated in a polymer membrane, was 17 μM against a strain of Escherichia coli. The above suggests the potential application of these membranes be incorporated in active packaging that prolongs the shelf life of foodstuff through the controlled release of the antimicrobial peptide.

Actualmente se generan pérdidas en los alimentos debido a la presencia de microorganismos alteradores, por lo tanto, se hace necesario el uso de empaques activos que funcionen como barrera de protección. Recientemente, se ha propuesto el uso de membranas ultrafinas incorporadas con compuestos antimicrobianos que potencialmente sirvan como adjuntos en empaques activos y favorezcan la liberación sostenida del compuesto. Dentro de los antimicrobianos incorporados se encuentran los péptidos, los cuales han demostrado su actividad antimicrobiana frente a un amplio espectro de microorganismos. Entre tanto, las membranas pueden ser elaboradas a partir de polímeros biodegradables mediante el aprovechamiento de nanotecnologías, siendo de particular interés la técnica de electrohilado (o electrospinning). No obstante las ventajas del uso de biopolímeros para la fabricación de membranas ultrafinas como dispositivos para empaques activos, estos presentan con frecuencia características indeseables, en especial una baja resistencia al agua, lo cual compromete su estabilidad estructural para este tipo de aplicaciones. Una alternativa de mejora consiste en la combinación de polímeros de distinta naturaleza que mejoren las propiedades de interacción con el agua de membranas ultrafinas, sin comprometer su biodegradabilidad y biocompatibilidad.

En este estudio, se desarrollaron membranas ultrafinas mediante la técnica de electrohilado a partir de una mezcla de polímeros para la incorporación del péptido palindrómico LfcinB (21-25)Pal, sintetizado a partir de la lactoferrina bovina, que ha demostrado tener actividad antimicrobiana frente a virus, bacterias y hongos. En primer lugar, se evaluó la factibilidad de producir membranas electrohiladas de pululano (PUL) – un polisacárido altamente hidrofílico-, de policaprolactona (PCL) –un poliéster biodegradable hidrofóbico, y de mezclas de PCL con polisacáridos poco solubles en agua (almidón modificado de papa y β-glucano). Estas membranas se caracterizaron morfológicamente por la técnica de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM), para observar la orientación de las fibras, su diámetro y la presencia de imperfecciones. Las características químicas se evaluaron por espectroscopia de infrarrojo (FTIR-ATR) para evaluar la presencia de los grupos funcionales característicos para cada fibra. Y por último, la humectabilidad se evaluó por medio de la técnica de ángulo de contacto. Una vez conocidas las propiedades de los materiales obtenidos, se realizó una membrana multicapa, en donde la capa externa estuvo compuesta de policaprolactona (PCL) y la capa interna de pululano (PUL), las cuales fueron caracterizadas adicionalmente por Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) para determinar la cristalinidad de las fibras.

Las membranas multicapa (PCL-PUL-PCL) poseen características estructurales de fibras cilíndricas y lisas, con un diámetro aproximado de 100 nm y una estabilidad térmica a temperaturas entre 200oC y 300oC. Los espectros FTIR de las membranas confirmaron que el electrohilado no generó modificaciones en la estructura de los polímeros. Basado en lo anterior, estas membranas fueron elegidas para la encapsulación del péptido, el PUL se usó como agente encapsulante del péptido y la PCL se empleó para recubrir al PUL debido a que el primero posee un carácter altamente hidrofóbico, lo que mantuvo la integridad de la membrana en presencia de agua.

Posteriormente, se logró encapsular, con una eficiencia de 65%, el péptido LfcinB (21- 25)Pal dentro de las fibras de PUL a una carga máxima de 50 mg péptido/g de PUL para luego recubrirlas con PCL. Estas membranas fueron caracterizadas estructural, física y morfológicamente. El análisis FTIR evidenció que no hubo modificaciones químicas en los polímeros ni el péptido después del electrohilado. La evaluación de la actividad antioxidante por DPPH mostró que las membranas a la mayor carga del péptido poseen una actividad antiradicalaria de 5.88x10-4 mg de ácido gálico/mg membrana. En estudios previos realizados por el grupo de investigación se encontró que la concentración mínima inhibitoria del péptido, cuando se encapsula en una membrana polimérica (PUL), fue de 17μM frente a una cepa de Escherichia coli. Lo anterior sugiere el potencial aplicativo de estas membranas para ser incorporadas en empaques activos que prolonguen la vida útil de los alimentos a través de la liberación sostenida del péptido antimicrobiano.