Desarrollo de tabaco genéticamente modificado portador del gen phaC de Aeromonas caviae para la síntesis de polihidroxialcanoatos

Abstract

En este trabajo se planteó un modelo basado en Derechos de Propiedad Intelectual (DPI) para generación de productos de interés industrial en tabaco (Nicotiana tabacum L.) que aporte en nuevos usos comerciales del cultivo. Este modelo comprende análisis del estado de patentes asociadas a los elementos implicados en un avance biotecnológico, y así establecer una estrategia que permita alcanzar un producto con una carga mínima de patentes asociadas que hagan factible su liberación comercial (denominado Estudio de Libertad de Operación - ELO). Este diseño se usó en el desarrollo de líneas genéticamente modificadas (GM) de tabaco, portadoras del gen phaC de Aeromonas caviae para síntesis de polihidroxialcanoatos en peroxisomas, para lo cual se realizó un ELO especifico con el cual se estableció un esquema que incluye el uso de casetes de expresión sintéticos de uso comercial para ser clonados en vectores de libre acceso pCAMBIA, transformación del vector en la cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (protegida por cinco patentes vigentes hasta 2032), la patente que cubre el método de transformación de este trabajo tiene vigencia hasta 2023. Además se identificaron 16 patentes relacionadas con los elementos relevantes para el desarrollo de una línea GM de tabaco productora de polihidroxialcanoatos en peroxisomas: secuencia promotora, codificante y terminadora, vector de transformación, cepa de A. tumefaciens para transformación, y péptido de tránsito, de las cuales 11 se encuentran vigentes. La variedad Samsun con la que se trabajó tiene titulos de obtentor de Variedades vegetales caducados. Se diseñaron dos casetes de expresión con el transgen phaC de A. caviae y péptido de tránsito a peroxisomas, con ajuste de uso codónico para N. tabacum (denominado PHACAcMOD) y sin modificación de uso codónico (denominado PHACA.c), los cuales fueron insertados en el genoma de tabaco, logrando una frecuencia de transformación de 0.78 % con el transgen PHACAcMOD y 3.9 % con el transgen PHACA.c para la variedad Samsun. Las plantas transformadas produjeron 0.36 mg de polihidrobutirato, con observación de gránulos relacionados en peroxisomas. El modelo experimental basado en DPI fue aplicado a la variedad Virginia k326, proceso cubierto por el mismo tipo y número de patentes, y titulos de obtentor de Variedades vegetales caducados, alcanzando frecuencias de transformación de 1.56 % con el constructo PHACAcMOD y 4.29 % con la construcción PHACA.c. Finalmente, siguiendo el mismo esquema apoyado en DPI, se transformó ambas variedades con un casete de expresión codificante de la parasporina 6 de Bacillus thuringiensis (una proteína con actividad anticancerígena) usando procedimientos experimentales idénticos, como perspectiva para producción de biofarmacos en tabaco. En el análisis de propiedad intelectual se identificaron siete patentes que protegen parasporinas en general con vigencia hasta 2033, ninguna patente específicamente cubre a la parasporina 6. (texto tomado de la fuente)

Here we present a model based on Intellectual Property Rights (IPR) for the production of industrial goods in tobacco (Nicotiana tabacum L) in order to develop new commercial uses for this crop. This model comprises a Freedom to Operate (FTO) analysis of the patents related to the elements involved in a biotechnological product in order to establish a strategy to develop a product with the minimum associated patent load and, therefore, facilitate its eventual commercialization. This approach was used in the development of Genetically Modified (GM) tobacco lines carrying the phaC gene from Aeromonas caviae for the production of polyhydrohyalkanoates in peroxisomes. For this, a case specific FTO analysis was carried out. Based on this analysis we outlined a strategy that includes the use of commercial synthetic expression cassettes cloned in free-access vectors (CAMBIA) and the transformation of Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 with these vectors. This bacterial strain is protected by five patents in force until 2032, but the patent covering the transformation method used here expires in 2023. We identified 16 patents related to relevant elements involved in the development of a GM tobacco line that produces polyhydroxyalkanoates in peroxisomes (promoter, coding and terminator sequences, transformation vector, A. tumefaciens strain, and transit peptide). Of these, eleven are still in force. Samsun tobacco variety was protected by Plant Breeder’s Rights, but these are now expired. We designed two expression cassettes with the A. caviae phaC gene and a peroxisomal transit peptide. The sequence of one of these was adjusted to optimize it for N. tabacum codon usage (PHACAcMOD) while the other was not modified for codon usage (PHACA.c). These expression cassettes were transformed into the tobacco (var. Samsun) genome with a frequency of 0.78 % (PHACAcMOD) and 3.9 % (PHACA.c). Transformed plants produced 0.36 mg of polyhydroxybutyrate and related peroxisomal granules were observed. This IPR based experimental model was applied to N. tabacum var. Virginia k326, in a process covered by the same type and number of patents and expired Plant Breeder’s Rights, with a transformation frequency of 1.56 % for PHACAcMOD and 4.29 % for PHACA.c. Following the same IPR based approach and identical experimental methods, both tobacco varieties were also transformed with an expression cassette coding for Bacillus thuringiensis parasporin 6 (a protein with anticancer activity) as a perspective for the production of biopharmaceuticals in tobacco. An IP analysis of this gene led to the identification of seven patents protecting parasporins in general, in force until 2033, but none covering parasporin 6 specifically.