Caracterización molecular y diagnóstico temprano de Lasiodiplodia sp. y Ceratocystis sp. en plantas de cacao y aguacate

Abstract

Lasiodiplodia sp. y Ceratocystis sp. son parásitos facultativos que se caracterizan por permanecer en estados de latencia prolongados y colonizar el sistema vascular de las plantas sin producir síntomas en las primeras etapas de infección. El inóculo puede ser dispersado a través de material vegetal de propagación aparentemente sano, y por ende, resulta necesario desarrollar técnicas para detectar de manera temprana estos patógenos cuando la densidad de inóculo es muy baja y la planta no presenta sintomatología. El objetivo de esta investigación fue caracterizar molecularmente los aislados de una colección de Lasiodiplodia sp. y Ceratocystis sp. provenientes de muestras de Theobroma cacao L. y Persea americana Mill. con el fin de identificar marcadores específicos y diseñar una PCR para el diagnóstico temprano de estos patógenos a partir de tallos de plántulas infectadas. Para ello, se amplificaron las regiones ITS y los genes β-tubulina y TEF-1α y con base en las secuencias obtenidas se realizaron los análisis filogenéticos respectivos para llegar a la identificación a nivel de especie de cada uno de los aislados. Posteriormente, con tres de los aislados fúngicos se realizó la inoculación de plántulas de T. cacao y P. americana bajo condiciones semicontroladas y finalmente, la estandarización de una PCR anidada para el diagnóstico temprano. Las filogenias multigen demostraron que L. subglobosa es un patógeno compartido entre T. cacao y P. americana y que los marcadores β-tubulina y TEF-1α no presentan suficiente resolución para determinar las especies de Ceratocystis. Dada la dificultad en la distinción de especies crípticas de ambos patógenos, se utilizó la región ITS para diseñar una PCR-anidada género-específica para el diagnóstico temprano en tallos de plántulas infectados con los patógenos. El límite de detección de la prueba fue de 3.869 ng/μL para Lasiodiplodia sp. y de 221.5 pg/μL para Ceratocystis sp., y no se observaron amplificaciones inespecíficas frente al ácido nucleico de otros géneros fúngicos. También se demostró que la prueba desarrollada detectó los patógenos en tallos provenientes de plántulas asintomáticas inoculadas artificialmente a partir de los 7 dpi para Lasiodiplodia sp. y 9 dpi para Ceratocystis sp., por lo cual se propone su uso como herramienta de tamizaje para verificar que los injertos para propagar material vegetal se encuentren libres de inóculo (Texto tomado de la fuente).

Lasiodiplodia sp. and Ceratocystis sp. are facultative parasites characterized by prolonged dormancy and the ability to colonize the vascular system of plants without displaying symptoms in the early stages of infection. The inoculum can be spread through apparently healthy plant propagation material, and therefore, it is necessary to develop techniques for early detection of these pathogens when the inoculum density is low, and the plant remains asymptomatic. This research aimed to molecularly characterize isolates from a collection of Lasiodiplodia sp. and Ceratocystis sp. from samples of Theobroma cacao L. and Persea americana Mill. to identify specific markers and design a PCR for early diagnosis of these pathogens in infected seedling stems. For this purpose, ITS regions and the β-tubulin and TEF-1α genes were amplified and based on the sequence obtained, the respective phylogenetic analyses were carried out to allow a species-level classification of the isolates. Subsequently, three of the fungal isolates were inoculated in T. cacao and P. americana seedlings under semi-controlled conditions, and finally a nested PCR was standardized for early diagnosis. Multigene phylogenies revealed that L. subglobosa is a common pathogen of T. cacao and P. americana, and that the β-tubulin and TEF-1α markers do not provide sufficient resolution to identify Ceratocystis species. Given the difficulty in distinguishing cryptic species of both pathogens, the ITS region was used to develop a genus-specific nested PCR for early diagnosis in strains. The detection limit of the test was 3,869 ng/μL for Lasiodiplodia sp. and 221.5 pg/μL for Ceratocystis sp. and no unspecific amplifications using the nucleic acid of other fungal genera were observed. It was also demonstrated that the developed test detected pathogens in stems from asymptomatic artificially inoculated seedlings at 7 dpi for Lasiodiplodia sp. and 9 dpi for Ceratocystis sp. and therefore its use is proposed as a screening tool to verify that grafts for propagating plant material are free of inoculum.