Extraction, characterization, bioactivity, and bioavailability of peptides derived from Sacha Inchi (Plukenetia volubilis)

Abstract

Sacha Inchi (SI) (Plukenetia volubilis) is an oilseed plant native to the Amazon rainforest, traditionally utilized by indigenous communities for centuries. Recently, it has gained recognition as a promising crop due to its exceptional oil extraction yield, minimal post-harvest requirements, and market value. Known as a "superfood," SI is rich in polyunsaturated fatty acids, high-quality proteins, essential amino acids, dietary fiber, tocopherols, phytosterols, and phenolic compounds. The growing interest in plant-based protein sources has created opportunities for valorizing agri-food by-products, pushing the food industry toward best sustainable development. Therefore, in this study, a comprehensive review of the physicochemical characteristics, food applications, and biological activities of the main by-product: the Sacha Inchi Oil Press-Cake (SIPC), was conducted, highlighting its potential as a valuable agro-industrial by-product for use in the food, pharmaceutical, and cosmetic industries. Subsequently, the potential of SIPC for obtaining protein concentrates and isolates was explored using three extraction methods, varying pH levels (7.0 and 11.0) and salt concentrations (0% and 5%). This approach yielded seven protein fractions, which were characterized by protein content, electrophoretic profile, secondary structure, and techno-functional properties. Notably, extraction at pH 11.0 without salt resulted in a Sacha Inchi Protein Concentrate (SPC) with the highest values for protein content, extraction yield, and protein recovery. The proteins present in the SPC were analyzed, and their proteome was determined using HPLC-MS/MS, identifying 226 proteins with at least two unique peptides homologous to the Euphorbiaceae family, including several novel proteins not previously reported. Subsequently, the SPC underwent simulated gastrointestinal digestion (SGID) following the harmonized INFOGEST protocol. The gastric digests (GD, collected at 120 min) and intestinal digests (ID, collected at 240 min) were processed through ultrafiltration to obtain peptide fractions: < 3 kDa (labeled as GD1 or ID1), 3-10 kDa (labeled as GD2 or ID2), and > 10 kDa (labeled as GD3 or ID3). Additionally, the peptidome of these peptide fractions was determined. Using the find-pep-seq script, the peptides from the ID were compared with those obtained from the SPC to identify peptides resistant to SGID. This analysis yielded 416 sequences with a high confidence level. To evaluate the bioactivity of these peptides, including their antioxidant, antidiabetic, and immunomodulatory activities, in vitro, ex vivo, and in silico methodologies were employed. The antioxidant potential of the SPC and its digests was assessed, showing that both GD and ID exhibited significantly higher ABTS and ORAC values compared to the initial SPC. Specific fractions (GD1, GD2, GD3) significantly reduced reactive oxygen species (ROS) levels in RAW264.7 macrophages under basal conditions, while GD1 and GD2 also reversed lipopolysaccharide (LPS) induced damage, demonstrating the bioactivity of these peptide fractions. Notable peptides with antioxidant capacity included LQDWYDK and EWGGGGCGGGGGVSSLR. Moreover, the antidiabetic properties of the digested fractions were evaluated through α-amylase inhibition assays, revealing inhibitory activities ranging from 20% to 45%. Key peptides identified for this activity included RHWLPR, RATVSLPR, and QLSNLEQSLSDAEQR, which showed strong potential for inhibiting α-amylase through molecular docking, suggesting their ability to reduce postprandial glucose levels. The mechanism of inhibition was elucidated, revealing that critical amino acid hotspots of α-amylase (Trp58, Trp59, Tyr62, and Asp300) interacted with these peptides through hydrogen bonds, as well as hydrophobic and electrostatic interactions. Finally, gastric and intestinal fractions (<3 kDa) showed significant reductions in nitric oxide (NO) production, and the ID3 fraction significantly reduces TNF-α production in LPS-challenged RAW264.7 cells. Molecular docking between peptides such as PSPSLVWR, RHWLPR, YNLPMLR, and SDTLFFAR and the TLR4/MD-2 complex revealed binding affinities that were linked to immunomodulatory activity. Bioinformatics tools were employed to assess the bioavailability potential of antioxidant and immunomodulatory peptides. Utilizing platforms such as SwissADME and ADMETlab 2.0, the physicochemical properties, absorption, distribution, metabolism, and excretion (ADME) profiles were evaluated. The Bioavailability Score from SwissADME indicated that the antioxidant peptides RHWLPR and ALEETNYELEK, while not meeting all optimal criteria, can effectively bind to cell surface receptors, suggesting beneficial intracellular responses. Additionally, the MLCPP 2.0 tool identified these sequences as potential cell-penetrating peptides (CPPs), which could enhance the transport of larger and polar molecules. The analysis of anti-inflammatory peptides revealed that PSPSLVWR, RHWLPR, and YNLPMLR exhibit promising drug-likeness characteristics, with significant lipophilicity and a high probability of human intestinal absorption (0.92). Their low plasma protein binding values, below 90%, further indicate favorable distribution characteristics. Overall, this PhD thesis titled ‘Extraction, characterization, bioactivity, and bioavailability of peptides derived from Sacha Inchi (Plukenetia volubilis)’ is an original work that highlights the immense potential of Sacha Inchi Protein Concentrate (SPC) as a sustainable source of bioactive peptides with multifunctional applications in the food and pharmaceutical industries. By emphasizing the nutritional and functional benefits of Sacha Inchi, this research contributes to ongoing efforts to valorize agro-industrial by-products, promoting a circular economy through the integration of sustainable practices in food production and related health applications. Future research should focus on the chemical synthesis of the identified bioactive peptides, particularly RHWLPR, as well as the experimental validation of their multifunctionality and bioavailability.

La Sacha Inchi (SI) (Plukenetia volubilis) es una planta que produce semillas ricas en aceite originaria de la Amazonía, utilizada tradicionalmente por las comunidades indígenas durante siglos. Recientemente, ha ganado reconocimiento como un cultivo promisorio debido a su excepcional rendimiento para la extracción de aceite, escasos requisitos para su post-cosecha, y por su creciente valor en el mercado. Actualmente, la semilla es reconocida como un ‘superalimento’ debido a su composición única de ácidos grasos poliinsaturados, proteínas de alta calidad, aminoácidos esenciales, fibra dietética, tocoferoles, fitoesteroles y compuestos fenólicos. El creciente interés por fuentes de proteína de origen vegetal ha creado oportunidades para valorizar los subproductos de la industria agroalimentaria, impulsando a la industria de alimentos hacia un desarrollo más sostenible. En este sentido, en este trabajo de investigación se realizó una revisión exhaustiva de las características fisicoquímicas, aplicaciones alimentarias y actividad biológica del principal subproducto generado durante la extracción de aceite: la torta prensada del Sacha Inchi (Sacha Inchi Oil Press-Cake (SIPC), por sus siglas en inglés), destacando su potencial como un coproducto para su uso en la industria de alimentos, farmacéutica y cosmética. Posteriormente, se exploró el potencial de este coproducto para obtener concentrados y aislados de proteínas utilizando tres métodos de extracción, variando los niveles de pH (7.0 y 11.0) y concentraciones de sal (0% y 5%). Este enfoque permitió la obtención de siete fracciones proteicas, que se caracterizaron por su contenido de proteína, perfil electroforético, estructura secundaria y sus propiedades tecno-funcionales. Cabe destacar que la extracción a pH 11.0 sin adición de sales resultó en un Concentrado de Proteína de Sacha Inchi (SPC) con los valores altos en su contenido proteico, rendimiento de extracción y recuperación de proteínas. Las proteínas presentes en el SPC fueron analizadas y su proteoma fue determinado mediante HPLC-MS/MS, identificando 226 proteínas con al menos dos péptidos únicos homólogos a la familia Euphorbiaceae, incluyendo un grupo de nuevas proteínas no reportadas previamente. Posteriormente, el SPC fue sometido a digestión gastrointestinal simulada (SGID) siguiendo el protocolo armonizado INFOGEST. Los digeridos gástricos (GD, recolectados a los 120 min) e intestinales (ID, recolectados a los 240 min) fueron procesados mediante ultrafiltración para obtener fracciones peptídicas: < 3 kDa (rotuladas como GD1 o ID1), 3-10 kDa (rotuladas como GD2 o ID2) y > 10 kDa (rotuladas como GD3 o ID3). También, se determinó el peptidoma de estas fracciones peptídicas. Utilizando el script find-pep-seq, se compararon los péptidos del ID con los obtenidos en el SPC, para identificar péptidos resistentes a la SGID. Este análisis arrojó 416 secuencias con un alto nivel de confianza. Para evaluar la bioactividad de estos péptidos, incluyendo sus actividades antioxidantes, antidiabéticas e inmunomoduladoras, se emplearon metodologías in vitro, ex vivo e in silico. Se evaluó el potencial antioxidante del SPC y sus digeridos, evidenciando que tanto el GD como ID presentaron valores significativamente más altos de ABTS y ORAC en comparación con el SPC inicial. Fracciones específicas (GD1, GD2, GD3) redujeron significativamente los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en macrófagos RAW264.7 bajo condiciones basales, mientras que GD1 y GD2 también disminuyeron el daño inducido por lipopolisacárido (LPS), demostrando la bioactividad de estas fracciones peptídicas. Los péptidos LQDWYDK y EWGGGGCGGGGGVSSLR exhibieron una notable capacidad antioxidante. También, se evaluaron las propiedades antidiabéticas de las fracciones de digeridos mediante ensayos de inhibición de α-amilasa, mostrando inhibición de su actividad entre el 20% y el 45%. Los péptidos RHWLPR, RATVSLPR y QLSNLEQSLSDAEQR son clave para reducir los niveles de glucosa postprandial, luego de ser identificados como responsables para esta actividad, pues mostraron un fuerte potencial para inhibir la α-amilasa mediante acoplamiento molecular. Se elucidó su mecanismo de inhibición, revelando que los puntos aminoácidos clave (Trp58, Trp59, Tyr62 y Asp300) de la α-amilasa interactuaron con estos péptidos a través de enlaces de hidrógeno, así como interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. Finalmente, las fracciones gástricas e intestinales (<3 kDa) demostraron reducciones significativas en la producción de óxido nítrico (NO), y la fracción ID3 reduce significativamente la producción de TNF-α en células RAW264.7 desafiadas con LPS. El acoplamiento molecular entre los péptidos PSPSLVWR, RHWLPR, YNLPMLR y SDTLFFAR con el complejo TLR4/MD-2 reveló afinidades de unión relacionadas con la actividad antinflamatoria. Se emplearon herramientas bioinformáticas para evaluar el potencial bioactivo de péptidos antioxidantes e inmunomoduladores. Utilizando plataformas como SwissADME y ADMETlab 2.0, se evaluaron las propiedades fisicoquímicas, la absorción, la distribución, el metabolismo y los perfiles de excreción (ADME, por sus siglas en inglés). El ‘Bioavailability Score’ de SwissADME indicó que los péptidos antioxidantes RHWLPR y ALEETNYELEK, aunque no cumplieron óptimamente con todos los criterios, pueden unirse eficazmente a los receptores de superficie celular, con posibles respuestas intracelulares beneficiosas. Además, la herramienta MLCPP 2.0 identificó estas secuencias como potenciales péptidos que penetran células (CPPs, por sus siglas en inglés), lo que podría mejorar el transporte de moléculas más grandes y polares. El análisis de péptidos los péptidos antiinflamatorios PSPSLVWR, RHWLPR y YNLPMLR reveló que exhiben características prometedoras de similitud a fármacos, con una lipoficidad significativa y una alta probabilidad de absorción en el intestino humano (0.92). Sus bajos valores de unión a proteínas plasmáticas, por debajo del 90%, indican características de distribución favorables. En general, esta Tesis Doctoral titulada ‘Obtención, caracterización, bioactividad y biodisponibilidad de péptidos derivados del Sacha Inchi (Plukenetia volubilis)’ es una obra original que destaca el inmenso potencial de la SIPC como una fuente sostenible de péptidos bioactivos con aplicaciones multifuncionales en las industrias alimentaria y farmacéutica. Al enfatizar los beneficios nutricionales y funcionales del Sacha Inchi, esta investigación contribuye con los esfuerzos en curso para valorizar subproductos agroindustriales, promoviendo una economía circular a través de la integración de prácticas sostenibles en la producción de alimentos y aplicaciones relacionadas con la salud. La investigación subsecuente debe centrarse en la síntesis química de los péptidos bioactivos identificados, especialmente RHWLPR y la validación experimental de su multifuncionalidad y biodisponibilidad (Texto tomado de la fuente).