Identificación funcional de una nueva opsina como fotopigmento

Abstract

El análisis de secuencias de elementos involucrados en fotorecepción ha revelado la existencia de una nueva subfamilia de opsinas (Gr4), posiblemente acopladas a una proteína Go. Se ha sugerido que estas proteínas participan en una cascada de fototransducción novedosa, diferente de las cascadas mediadas por opsinas de tipo C y R, sin embargo la función de estas moléculas como fotopigmento no ha sido establecida en ningún sistema biológico. Una opsina perteneciente a este nuevo grupo, pScop2, es expresada en las células ciliadas de la retina del bivalvo Pecten irradians, en las cuales la fotorecepción es mediada por Go. En este trabajo se buscó evaluar si esta proteína es un fotopigmento funcional y determinar su participación en la cascada de fototransducción de las células ciliadas de Pecten irradians. La diálisis de anticuerpos, diseñados para interferir con la interacción pScop2-proteína G, falló en disminuir la fotosensibilidad de las células. Sin embargo, un acercamiento basado en RNAi disminuyó selectivamente la corriente de isomerización de fotopigmento, indicando su capacidad de fotoisomerización, y la corriente prolongada hiperpolarizante en estas células, lo cual muestra su relevancia en la cascada de fototransducción. La expresión heteróloga de pScop2 en líneas celulares sólo indujo fotosensibilidad pocas instancias, posiblemente por un problema de acoplamiento con vías de señalización endógenas. Para intentar obviar este problema, se hizo un intercambio del tercer bucle intracelular de esta opsina por el de otra opsina, pScop1, la cual es acoplada a una proteína Gq, y se registraron incrementos de calcio intracelular gatillados por un estímulo de luz en células HEK293 transfectadas con esta versión quimérica de pScop2, indicando su función como fotopigmento (Texto tomado de la fuente).

The existance of a new subfamily of Go coupled-opsins (Gr4), revealed by sequence analysis of fotoreception-related elements, has sugested their involvement in a novel phototransduction scheme, different from traditional R and C type Opsin mediated phototransduction. However, their function as photopigments has not been established on biological systems. One of these opsins, pScop2, is expressed in retinal ciliary photoreceptors of the scallop Pecten irradians, which transduce light in a Go dependent manner. The involvement of pScop2 in the phototransduction of ciliary photoreceptors was tested using antibody dialysis, designed to block pScop2-G-protein mediated transduction. This approach failed to reduce cell photosensitivity but a RNAi-based strategy selectively reduced early receptor currents, indicating pScop2’s capacity for photoisomerization, and prolonged hiperpolarizing aftercurents, which indicate it’s involvement in the transduction process in these cells. Heterologous expression of pScop2 in cultured cell lines only induced photosensitivity in a few instances, presumably due to poor coupling to native G-protein mediated signaling. In an attempt to obviate this problem, a modified version of pScop2 containing the intracellular loop 3 of a Gq-coupled opsin, pScop1, was created by PCR. This pScop2-Gq chimera produced light-triggered intracellular calcium increments in transfected cells, indicating pScop2’s function as a photopigment.