Caracterización de Propiedades Fı́sicas de Promastigotes y Amastigotes de Leishmania braziliensis en Cultivos in vitro Usando Ondas Acústicas Estacionarias y Microfluı́dica

Abstract

In this work acoustic standing waves were used in the ultrasonic range to manipulated Leishmania parasites. The aim of this manipulation was to identify changes in the physical properties of promastigotes and amastigotes, which can be related to the cytoskeleton alterations caused by genetic modifications or by parasite adaptation to different enviroments. 3D theoretical model was developed with a dynamical analysis to identify these changes in the parasites physical properties using the acoustic radiation force intensity determinated for Leishmania. It was found that the force magnitude is greater in promastigotes than amastigotes, effect that can be related with simultaneous changes in the parasite volume, density and elasticity by its adaptation to the extracellular enviroments that affect the cytoskeleton. However, differences in the magnitude of the Fpr are associated with the volume when transfected Leishmania parasites, at the same stage, are compared.

These results were obtained by measuring, first, the acoustic energy in the devices, where their values were defined between 7 and 9 J /m3 , and, second, and ,second, were determed physical properties of Leishmania such as its shape, by means of particle counter Coulter Beckman Z2 and microscopy images, density, measured with Percoll gradients, and elasticity, extracted indirectly from the 3D model. The physical properties were introduced in numerical simulation for establish Fpr magnitude in Leishmania. In addition, was found that the parasites have an acoustic contrast factor, positive, φ > 0, because these cells move towards the pressure node during acoustic field application. Region where the promastigotes arrive first than the amastigotes to form aggregates that rotate with respect to the node.

En este trabajo se usaron ondas acústicas estacionarias en el rango de los ultrasonidos generadas al interior de dispositivos microfluı́dicos, para manipular acústicamente parásitos de Leishmania. Esto se hizo con el propósito de identificar cambios en las propiedades fı́sicas de promastigotes y amastigotes, los cuales pueden estar relacionados con alteraciones en el citoesqueleto del parásito causadas por modificaciones genéticas o por su adaptación a los diferentes ambientes durante su ciclo de vida. Para identificar si hay cambios se determinó la intensidad de la fuerza primaria de radiación acústica, Fpr , que actuaba sobre diferentes cepas de Leishmania. Esto se logró al desarrollar un modelo físico en 3D mediante un análisis dinámico donde se establecieron las fuerzas que actuaban sobre los parásitos suspendidos en un líquido al interior de un dispositivo rectangular y sometidos a la acción de la Fpr . Encontrando, que la magnitud de la Fpr en promastigotes es mayor que en amastigotes efecto que está relacionado con cambios significativos en el volumen, densidad y elasticidad del parásito dados por su adaptación a los distintos ambientes, diferencia que no fue tan evidente al comparar los resultados obtenidos con parásitos de las diferentes cepas en el mismo estadio, donde la variación en la magnitud de la Fpr esta asociada con cambios en el volumen de Leishmania.

Para obtener estos resultados se midió primero la energía acústica en los dispositivos construidos, hallando valores entre 7 a 9 J/m3 , y luego se determinaron las propiedades físicas de Leishmania tales como su tamaño, con un contador de partículas Coulter Beckman Z2 e imágenes de microscopia, densidad, medida usando gradientes de Percoll, y elasticidad, extraída indirectamente del modelo 3D. La medición de estas propiedades mecánicas permitió, al introducir sus valores en la simulación numérica, establecer la magnitud de la Fpr sobre las células. Adicionalmente, se halló con los registros de manipulación acústica que el factor de contraste acústico en los parásitos es positivo φ > 0, puesto que al someter estas células a la acción de la Fpr se produjo un movimiento de conducción hacia zonas de equilibrio acústico, nodos de presión, donde se colectaron los parásitos durante la aplicación del campo. Posición que alcanzan más rápido los promastigotes que los amastigotes, según se determinó con la simulación computacional, en la cual, después de agregados los parásitos en sus dos estadios, estos rotan respecto al nodo.