Estudio de la enzima dextransacarasa (DS) producida por Leuconostoc mesenteroides cepa IBUN 91.2.98.

Abstract

Este trabajo estudia la enzima extracelular dextransacarasa (EC 2.4.1.5) producida por Leuconostoc mesenteroides IBUN 91.2.98, y se focaliza en tres aspectos: el primero: en el aumento de la actividad enzimática en el proceso de obtención por fermentación, como segunda instancia: un nuevo proceso de purificación de la enzima y una tercera parte la caracterización de la dextransacarasa purificada. Se establecieron las condiciones óptimas de fermentación para la producción enzimática de la dextransacarasa, (pH: 7 sin control, agitación: 150 r.p.m. y 0.5 v.v.m. de aireación) se logró un aumento en la actividad enzimática de 2.3 veces (6.9 U/ml) utilizando una relación (C/N) de 23,6; con estas condiciones se logró un tiempo de producción de la enzima de 4 horas; el cual es uno de los tiempos más cortos reportados. La enzima fue purificada utilizando una metodología que combina la inmovilización de la proteína en el biopolímero que produce (tipo dextrano) seguida de una etapa de concentración por ultrafiltración, utilizando una membrana con un tamaño de poro de 300 KDa y posterior hidrólisis del dextrano mediante la acción de una dextranasa y por último, la purificación de la enzima por cromatografía de intercambio aniónico. En el proceso de purificación se logró un factor de purificación de 118 y un rendimiento del 26% respecto al extracto inicial. La dextransacarasa purificada presenta una actividad específica de 335,1U/mg; por análisis electroforético se evidenció la ausencia de subunidades, y una masa molecular calculada en 170,1 kDa. y un punto isoeléctrico (pI) de 4,2. La enzima purificada presentó una Vmax de 27,1 U/ml y un Km de 4,9 mM. Las condiciones óptimas de pH, temperatura y concentración de sustrato fueron de 5, 30°C y 584 mM de sacarosa respectivamente con una relación de 0.4 U/ mol de sustrato. La actividad dextransacarasa fue fuertemente inhibida por los cationes Fe+3 (96.5%) y Al+3 (99.1%), mientras que los cationes Mg+2y K+ actuaron como activadores en un 36.7% y 27.2%, respectivamente. Mediante el análisis por espectrofotometría de masas (MS)se encontró un 25% de homología con la proteína dextransacarasa DsrD de la cepa Leuconostoc mesenteroides Lcc4, y clasificarla en la familia glucosil- hidrolasas 70 (GH70).

Abstract: This paper studies the extracellular enzyme dextransucrase (EC 2.4.1.5) produced by Leuconostoc mesenteroides IBUN 91.2.98, and focuses on three aspects: first: the increase in enzyme activity in the production process by fermentation, as second instance: a new method of purification of the enzyme and a third characterization of purified dextransucrase. Optimal fermentation conditions for the enzymatic production of dextransucrase were established (pH: 7 uncontrolled agitation: 150 r.p.m. and 0.5 v.v.m. aeration) achieved an increase in the enzymatic activity of 2.3 times (6.9 U / ml) using a ratio (C / N) of 23.6; these conditions are clocked producing the enzyme in 4 hours; which is one of the short times reported. The enzyme was purified using a method which combines the immobilisation of the protein produced in the biopolymer (dextran type) followed by a concentration step by ultrafiltration, using a membrane with a pore size of 300 KDa and subsequent hydrolysis of dextran by action of a dextranase and finally the purification of the enzyme by anion exchange chromatography. 118 and a yield of 26% over the initial extract: In the process of purification factor was achieved. Purified dextransucrase has a specific activity of 335,1U / mg; Electrophoretic analysis by the absence of subunits, and a calculated molecular mass in kDa evidenced 170.1. and an isoelectric point (pI) of: 4.2. The purified enzyme presented a Vmax of 27.1 U / mL and Km:4,9 mM. Optimal conditions of pH, temperature and concentration of substrate were 5, 30 ° C and 584 mM sucrose in a ratio respectively of 0.4 U / mole of substrate. The dextransucrase activity was strongly inhibited by the Fe+3 (96.5%) and Al+3 (99.1%) cations, whereas cations K+ y Mg+2 acting as activators in 36.7% and 27.2% respectively. By analysis by mass spectrometry (MS) was found 25% homology with the dextransucrase protein DSRD Leuconostoc mesenteroides strain Lcc4, and classify the glucosyl hydrolases family 70.