Compuestos tipo alcaloides quinolínicos y limonoides (triterpenos) sintéticos con potencial anti-leishmania: una aproximación al mecanismo de acción

Abstract

La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria antropozoonótica, causada por el protozoario del género Leishmania spp. y transmitida por el mosquito del genero Lutzomya. Dentro de las formas clínicas de la enfermedad, la cutánea, constituye la manifestación mas frecuente en el mundo, y corresponde a más del 90% de los casos resportados en Colombia y en el mundo. Una de las dificultades más evidentes en el control de esta enfermedad, ha sido el tratamiento, el cual además de haber reportado pérdida de eficacia, presenta efectos adversos, largos esquemas de tratamiento y formas de administración de baja adherencia por parte del paciente, que generan el abandono del mismo y la generación de cepas resistentes. Por esta razón, la búsqueda de alternativas terapéuticas de aplicación tópica constituye una necesidad de alta prioridad, para disminuir el problema de salud pública que conlleva esta enfermedad. De este modo, en estudios previos realizados en el Grupo de Investigación en Inmunotoxicologia se identificaron dos moléculas de origen vegetal con propiedades antileishmaniales, correspondientes a alcaloides quinolínicos (N-metil-8-metoxiflindersina) y triterpenoides de tipo limonoide (11α,19β-dihidroxi-7-acetoxi-7-deoxoichangina), con efecto directo frente al parásito y propiedades inmunoduladoras en células humanas infectadas por el parásito; sin embargo, el origen (a partir de material vegetal de Raputia heptaphylla) y las dificultades que conllevan la extracción y la purificación, conllevó al diseño de estrategias para encontrar moléculas con características estructurales afines, bajo el principio de propiedades similares (PPS). Entre los hallazgos mas relevantes obtenidos en este trabajo, se encuentran los resultados obtenidos con compuestos de origen sintético y análogos a las moléculas naturales, los cuales fueron seleccionados por medio de estrategias In silico: triterpenoides [ácido oleanólico (5), glicirrizato de amonio (7) y ácido 18B-glicirretínico (8)] y alcaloides quinolínicos [1,2,3,4-tetrahidro-(benzo)-3-qinolin-ol (13) y 2-amino-8-hidroxiquinolina (19)] los cuales presentaron actividad anti-leishmanial In vitro [sobre promastigotes (13 y 19) y amastigotes intracelulares de L. (V.) panamensis (5, 7, 8, 13 y 19)] e In vivo [promoviendo la cura clínica (entre un 20% (8), 33,3% (13) y 50% (19) los animales cicatrizan completamente la lesión) y mejoría clínica (100% (5), 80% (7), 60% (8), 66,6% (13) y 33.3% (19), reducción en al menos un 20% el tamaño de la lesión), de los animales tratados con los compuestos, administrados de forma tópica]. De acuerdo con los efectos de cada compuesto, se propusieron modelos de aproximación al modo de acción de cada molécula. Los triterpenoides 5 y 7 mostraron característica de pro-fármacos (actividad evidente sobre la foma amastigote en MdMhu infectados), pero con afectaciones diferenciales en el amastigote intracelular para el triterpenoide 5 [causa muerte de tipo necrosis (presencia de membranas hinchadas o alteradas, acidocalcisomas y daño nuclear)] y saponina 7 [(afinidad por la mitocondria de MdMhu y parásitos (causando en Leishmania spp. estrés celular, la parición de acidocalcisomas e hinchamiento de membranas celulares)]. El triterpenoide 8 indujo el incremento diferencial de NO, a través de la modulación de iNOS vía NF-kB en macrófagos infectados y modificaciones en los amastigotes (citoquinesis alterada y señales de apoptosis). Se resaltan los hallazgos de los compuestos alcaloides (13 y 19), los cuales fueron activos frente a los dos estadios del parásito (promastigotes y amastigotes). El alcaloide 13, actúa sobre reservas de lípidos y componentes de membrana [(reflejado en el aumento de cuerpos lipídicos y vacuolas parasitóforas comunales en MdMhu)], causando el estrés celular de los parásitos (presencia de acidocalcisomas y citoquinesis alterada) y la disminución de la carga parasitaria en estas células, induciendo el aumento temprano de ROS en MI, contribuyendo así con el control temprano del parásito. Mientras que el efecto del compuesto 19 está dirigido hacia la modulación de procesos de generación de energía y respiración oxidativa (producción de especies reactivas en promastigotes y despolarización de la mitocondria), los cuales conducen a los parásitos a la muerte de tipo apoptosis (hinchamiento de membranas celulares, presencia de acidocalcisomas y distribución anormal de cromatina) y que se asocian con la expresión diferencial de proteínas (spots) en amastigotes expuestos al alcaloide; mientras que en las células hospederas infectadas, se induce apoptosis, mostrando la selectividad del compuesto.

Estos resultados permiten soportar nuestro modelo de búsqueda de compuestos, en donde a partir de moléculas de difícil obtención (origen vegetal), se pueden encontrar antileishmaniales promisorios. Se destaca, que para cada molécula antiparasitaria encontrada en este proyecto, se identificó un posible modo de acción en el modelo de células primarias, así como su efectividad terapéutica en un modelo In vivo; estos hallazgos contribuyen al entendimiento de la forma de actuación de este tipo de compuestos y abre el camino para la optimización y tratamiento de la leishmaniasis cutánea en el país.

Leishmaniasis is an anthroponotic parasitic disease, caused by the protozoan of the genus Leishmania spp. and transmitted by the mosquito of the genus Lutzomya. This disease has been classified as a neglected pathology by the WHO because its presence is established in tropical and sub-tropical areas and mainly in developing countries. Within the clinical forms of the disease, the cutaneous form constitutes the most frequent manifestation in the world, which corresponds to more than 90% of the cases reported in Colombia and the world. One of the most obvious difficulties in the control of this disease has been treated, which is accompanied by adverse effects, long treatment schedules, and forms of administration that are not very friendly to the patient, which generate the abandonment of treatment and the generation of resistant strains. For this reason, the search for therapeutic alternatives for topical application constitutes an imperative need to mitigate the public health problem that this disease entails. Thus, in previous studies carried out by the Immunotoxicology research group, two molecules with antileishmanial properties were identified, corresponding to quinolinic alkaloids (N-methyl-8-methoxyflindersine) and limonoid-type triterpenoids (11α, 19βdihydroxy-7- acetoxy-7-deoxoichangin), with direct effect against the parasite and immunomodulatory properties in human cells infected by the parasite; however, the origin (from Raputia heptaphylla plant material) and the difficulties involved in extraction and purification, led to the design of strategies to find molecules with similar structural characteristics, under the principle of similar properties (PPS). Among the most relevant findings obtained in this work, are the results obtained with the five compounds of synthetic origin and analogous to natural molecules (previously evaluated by the research group), which were selected through the In silico strategies: Triterpenoid compounds [oleanolic acid (5), ammonium glycyrrhizate (7) and 18B-glycyrrhetinic acid (8)] and quinolinic alkaloids [1,2,3,4-tetrahydro- (benzo) -3-qinolin-ol (13) and 2-amino-8- hydroxyquinoline (19); which presented anti-leishmanial activity In vitro [on promastigotes (13 and 19) and intracellular amastigotes of L. (V.) panamensis (5, 7, 8, 13 and 19)] and In vivo [promoting clinical cure (between 20% (8), 33.3% (13) and 50% (19) the animals completely heal the lesion) and clinical improvement (100% (5), 80% (7), 60% (8), 66,6% (13) and 33.3% (19), reduction of lesion size by at least 20%), of the animals treated with the compounds, administered topically]. Each synthetic antileishmanial compound showed evident effects in the model used, giving rise to models of approximation to its mode of action. Triterpenoids 5 and 7 showed prodrug activity [(Activity in the amastigote form), in addition to causing necrosis-type death in the intracellular parasite (presence of swollen or altered membranes, acidocalcisomes, and nuclear damage) by the compound 5, while saponin 7 had an evident affinity for the mitochondria of MdMhu and parasites (causing cellular stress, the calving of acidocalcisomes and swelling of cell membranes in Leishmania spp.)]. Triterpenoid 8 (synthetic pentacyclic) revealed immunomodulatory properties by inducing the differential increase in NO, through modulation of iNOS via NF-kB in infected macrophages and evident alterations in amastigotes (altered cytokinesis and apoptosis signals), possibly as an effect of NO. The findings of the alkaloid compounds (13 and 19) are highlighted, which had evident activity against the two stages of the parasite (promastigotes and amastigotes). The alkaloid 13 acts on lipid reserves and membrane components [(reflected in the increase of lipid bodies and communal parasitophorous vacuoles in MdMhu)], causing cellular stress of the parasites (presence of acidocalcisomes and altered cytokinesis) and the decrease of the parasite load in these cells inducing the early increase of ROS in MI, contributing to the early control of the parasite. The effect of compound 19 evidenced in intracellular promastigotes and amastigotes is directed towards the modulation of processes of energy generation and oxidative respiration (production of reactive species in promastigotes and depolarization of the mitochondria), which lead parasites to death of the type apoptosis (swelling of cell membranes, presence of acidocalcisomes and abnormal chromatin distribution) and that are associated with the differential expression of proteins (spots) in amastigotes exposed to the alkaloid; while in host cells, the induction of early apoptosis was differentially evidenced in infected cells, showing the selectivity of the compound. These results allow us to support our compound search model, where promising antileishmanial can be found from difficult-to-obtain molecules (plant origin). It should be noted that for each antiparasitic molecule found in this project, a possible mode of action was identified in the primary cell model, as well as its therapeutic effectiveness in an In vivo model; These findings contribute to the understanding of how this type of compound works and opens the way for the optimization and treatment of cutaneous leishmaniasis in the country.