Evaluación funcional del péptido EAR-20 como posible agonista de los receptores ionotrópicos de glutamato de tipo NMDA

Abstract

La modulación alostérica de la función proteica supone un importante mecanismo de regulación biológica. Por lo tanto, este tipo de modulación proporciona nuevas dianas para la intervención terapéutica. Los receptores ionotrópicos para el neurotransmisor glutamato tipo N-metil-D-aspartato (NMDARs) son complejos proteicos que desempeñan un papel importante en la función neuronal, siendo claves para la correcta maduración y plasticidad de los contactos sinápticos neuronales, por lo que el control de las propiedades del receptor mediante modulación alostérica podría tener importantes repercusiones sobre los procesos de cognición y comportamiento, lo cual es de especial relevancia en procesos o patologías en las cuales existe una disfunción de los NMDARs. Con el propósito de indagar sobre nuevas dianas de modulación alostérica de los NMDARs, en el grupo de investigación de proteínas (GRIP) de la Universidad Nacional de Colombia se diseñaron una serie de péptidos derivados de la Conantokina-G (Con-G), un documentado antagonista de los NMDARs, como estrategia para regular la actividad de los NMDARs. El objetivo de esta tesis doctoral está basado en la evaluación funcional del péptido EAR-20 (uno de los péptidos diseñados) mediante ensayos electrofisiológicos. Inicialmente nuestros estudios mostraron que el péptido EAR-20 puede activar parcialmente los NMDARs incluso en total ausencia de los co-agonistas naturales (glutamato y glicina). De forma interesante también se vio que EAR-20 actúa como un modulador alostérico positivo (PAM; del inglés positive allosteric modulator), ya que esté es capaz de potenciar la respuesta del NMDAR a sus agonistas, y disminuir la desensibilización del receptor. En relación con lo anterior, se determinó que las EC50 del péptido EAR-20 como PAM de las corrientes mediadas por GluN1-GluN2A y GluN1- GluN2B fueron 88.74 µM y 42.23 µM respectivamente. Además, EAR-20 mostró una potenciación máxima de 153.30 ± 19.90 % en receptores GluN1-GluN2A, 143.75 ± 26.80 % en receptores GluN1-GluN2B y 102.45 ± 11.10 % en receptores GluN1-GluN2D. En cambio, sobre los di-heterómeros GluN1-GluN2C la actividad PAM de EAR-20 fue de tan solo 26.59 ± 7.70 %. Estos resultados muestran que EAR-20 tiene un efecto similar en los receptores di-heteroméricos ensamblados con las subunidades GluN2A ,GluN2B y GluN2D, y una muy baja actividad PAM hacia los NMDARs ensamblados con la subunidad GluN2C. De igual forma cuando ensayamos la actividad PAM de EAR-20 sobre los triheteroméros GluN1-GluN2A-GluN2B encontramos que esta era significativamente menor, alrededor de un 25.84 ± 3.0 %. En relación con esto, la actividad PAM de EAR-20 sobre los NMDARs nativos de neuronas piramidales hipocampales fue considerablemente menor a la encontrada en los di-heterómeros ensamblados con las subunidades GluN2A y GluN2B. Finalmente se estudió el efecto de EAR-20 sobre NMDARs conformados por subunidades con mutaciones que provocan una pérdida de función del receptor, encontrándose que EAR-20 es capaz de potenciar la actividad de este tipo de receptores, lo que indica que la modulación del NMDAR supondría una posible estrategia de cara a mitigar la disfunción del NMDAR. (Texto tomado de la fuente).

Allosteric modulation of the protein function is an important mechanism of biological regulation. Therefore, this type of modulation provides new targets for therapeutic intervention. The ionotropic receptors for the neurotransmitter glutamate belonging to the N-methyl-D-aspartate (NMDARs) type are protein complexes that play an important role in neuronal function, being key for the correct maturation and plasticity of neuronal synaptic contacts. Thus, the control of the receptor’s properties through allosteric modulation could have important repercussions on the processes of cognition and behavior, which is of special relevance in the development of pathologies associated with NMDARs-dysfunction.

With the aim to investigate new targets for allosteric modulation of NMDARs, the protein research group (GRIP) of the National University of Colombia designed a series of peptides derived from Conantokin-G (Con-G), a well-documented antagonist of NMDARs, as a strategy to regulate the NMDARs activity. The objective of this doctoral thesis is based on the functional evaluation of the peptide EAR-20 (one of the peptides designed) through electrophysiological tests.

Firstly, our studies showed that the EAR-20 peptide can partially activate NMDARs even in the total absence of natural co-agonists (glutamate and glycine). Interestingly, it has also been seen that EAR-20 acts as a positive allosteric modulator (PAM), since it is able to potentiate the response of the NMDAR to its agonists and to reduce receptor desensitization. The EC50 of the EAR-20 peptide as PAM of the currents mediated by GluN1-GluN2A and GluN1-GluN2B was determined to be 88.74 µM and 42.23 µM, respectively. Additionally, EAR-20 produces a maximal potentiation of 153.30 ± 19.90% on GluN1-GluN2A receptors, 143.75 ± 26.80% on GluN1-GluN2B receptors, and 102.45 ± 11.10% on GluN1-GluN2D receptors. By contrast, on the di-heteromers GluN1-GluN2C, the PAM activity of EAR-20 was only 26.59 ± 7.70%. These results show that EAR-20 has a similar effect on di-heteromeric receptors assembled with the GluN2A, GluN2B and GluN2D subunits, and a very low PAM activity towards NMDARs assembled with the GluN2C subunit. Similarly, when we tested the PAM activity of EAR-20 on the tri-heteromers GluN1-GluN2A-GluN2B, we found that it was significantly lower, around 25.84 ± 3.0%. A similar low PAM activity was found for EAR-20 acting on the native NMDARs of pyramidal hippocampal neurons, which was considerably different to the one found in the di-heteromers assembled with the GluN2A and GluN2B subunits. Finally, it was studied the effect of EAR-20 on NMDARs conformed by subunits with mutations that cause loss of function of the receptor, finding that EAR-20 can enhance the activity of this type of receptor indicating that the modulation of NMDAR might be a possible strategy to mitigate NMDAR dysfunction.