Safrol y Apiol: metabolismo, preparación de derivados y actividad antifúngica contra el hongo fitopatógeno Botryodiplodia theobromae

Abstract

Resumen: En el presente trabajo, los fenilpropanoides safrol y apiol (dillapiol) se obtuvieron de fuentes naturales, puntualmente desde las especies Piper auritum Kunth. (Pa) y Piper holtonii C.DC. (Ph); respectivamente. Además, se realizó una evaluación previa de la actividad antifúngica in vitro mediante la técnica del agar envenenado, contra el hongo fitopatógeno Botryodiplodia theobromae, tanto de estos metabolitos como de extractos de diferente polaridad provenientes de ambas especies. Los análisis de composición química de los extractos revelaron que la mayor inhibición está posiblemente relacionada con el contenido de safrol en P. auritum (56,88 % en el extracto hexánico, EH; y 64,54 % en el aceite esencial, AE) y apiol en P. holtonii (57,20 % en EH y 64,24 % en AE). Ambos compuestos se purificaron por métodos cromatográficos, y sus estructuras se confirmaron por resonancia magnética nuclear (RMN) de protón y carbono 13; y con ayuda de los fragmentos obtenidos de la espectrometría de masas. Adicionalmente, se analizó el metabolismo de safrol y apiol por parte del hongo B. theobromae incubado en el medio Czapeck Dox durante 216 h; como productos mayoritarios de la biotransformación se aislaron e identificaron los correspondientes dioles vecinales sobre la cadena lateral. Otros metabolitos minoritarios también se detectaron por cromatografía de gases. Para observar el progreso del proceso metabólico se hizo un estudio en el curso del tiempo mediante CG-EM cada 12 h hasta las 120 h, y luego cada 48 h hasta las 316 h. De estos estudios se observó que para el safrol, donde la actividad antifúngica es moderada, la capacidad de metabolización es baja; mientras que para el apiol, que presentó una actividad relativamente alta, este microorganismo consigue después de 60 h iniciar el proceso de transformación; proceso que continuó durante el tiempo restante del ensayo. A partir de estos resultados se postula una posible ruta metabólica. Por último, se prepararon algunos derivados del safrol y apiol (por nitración del anillo aromático y reducción del grupo nitro hasta amino) y se evaluaron contra el hongo fitopatógeno; esto con el fin de establecer el efecto de las variaciones estructurales sobre la actividad antifúngica in vitro. Estos resultados brindan información importante acerca de la bioquímica de la interacción entre los hongos fitopatógenos y los fenilpropanoides. Información que puede ser utilizada en el desarrollo racional de nuevas y mejoradas sustancias antifúngicas.

Abstract: In the present work, the phenylpropanoids safrole and apiol (dillapiol) was obtained from natural sources, punctually from Piper auritum Kunth. (Pa) and Piper holtonii C.DC. (Ph) species; respectively. Moreover, a previous in vitro antifungal activity was realized by the poisoned agar technique, against phytopathogenic fungi Botryodiplodia theobromae, both the metabolites as the different polarity extracts of both species. The chemical composition analysis of the extracts reveals that the major inhibition was likely related with safrole content in P. auritum (56,88 % in hexanic extract, HE; and 64,54 % in the essential oil, EO). Both compounds were purified by chromatographic means, and their structures were confirmed by proton and 13 carbon nuclear magnetic resonance (NMR); and using the fragments obtained from mass spectrometry. Furthermore, the metabolism of safrole and apiol by the fungus B. theobromae cultured in Czapeck Dox media during 216 h was analyzed; as the major products from the biotransformation, the corresponding vicinal diols upon the lateral chain were analyzed and identified. Other minor metabolites were also detected by gas chromatography. To observe the metabolic process progress, a time course analysis by GC-MS was done, each 12 h until 120 h, and then each 45 h to the 316 h. from these studies was observed that for safrole, where the antifungic activity is moderate, the metabolic capability is low. While for apiol, which showed a relatively high activity, this microorganism gets start the biotransformation process after 60 h; process that continues for the remainder of the assay. From these results a plausible metabolic pathway is postulated. Finally, some derivatives for safrole and apiol were prepared (by nitration of the aromatic ring and reduction of the nitro group to amino) and were tested against the phytopathogenic fungus; this, with the aim of establishes the structural variation effect on the in vitro antifungal activity. These results offer valuable information about the biochemistry of the interaction between phytopathogenic fungi and the phenylpropanoids.