ATPasas tipo P2 como blancos para la atenuación de Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por el bacilo ácido alcohol resistente Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La TB es una amenaza para la salud pública, debido a su alta incidencia, la aparición de cepas multi-fármaco-resistentes (MDR) y extremadamente-fármaco-resistentes (XDR), la coinfección con VIH y la eficacia limitada de la vacuna BCG. El diseño de nuevas estrategias de control requiere una mejor comprensión de los mecanismos moleculares utilizados por Mtb para ser un patógeno intracelular tan exitoso. En este sentido, algunos estudios han sugerido la importancia de las ATPasas tipo P en la fisiología y la supervivencia intracelular de las micobacterias.

Un meta-análisis del perfil transcripcional de las ATPasas tipo P de Mtb bajo condiciones de estrés como hipoxia, estrés oxidativo, inanición, intoxicación por agentes químicos y procesos de infección in vitro e in vivo, evidenció la expresión diferencial de estos transportadores frente a estas condiciones. De las 12 ATPasas tipo P presentes en el genoma de Mtb, CtpF, que codifica para un transportador de Ca2+, es la ATPasa que muestra mayores niveles de transcripción en las diferentes condiciones de estrés. Particularmente, varias ATPasas tipo P (ctpF, ctpG, ctpC, ctpH y ctpV) exhibieron un aumento en los niveles de expresión durante la infección de macrófagos humanos, sugiriendo la importancia de dichas proteínas en los procesos de infección. Considerando la relevancia funcional de las ATPasas tipo P, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar el efecto de la deleción de ATPasas tipo P transportadoras de metales alcalino/alcalinotérreos en la viabilidad y virulencia de Mtb. Para lograr este objetivo, mediante técnicas de recombinería se construyeron los mutantes defectivos en los genes ctpF y ctpH de Mtb, y a partir de distintos análisis funcionales con las cepas mutantes, se demostró que ambos transportadores están implicados en el eflujo de Ca2+. Adicionalmente, las cepas mutantes (MtbΔctpF y MtbΔctpH) mostraron hipersensibilidad frente agentes oxidantes en comparación con la cepa tipo silvestre (MtbWT), indicando un vinculo entre el transporte de Ca2+ y los mecanismos que utiliza el bacilo para neutralizar especies reactivas del ambiente intrafagosomal.

Por otro lado, se evaluó en un modelo celular y animal el efecto de la deleción del gen ctpF en la virulencia Mtb. Así, se evidenció que dicha mutación genera una disminución significativa en la capacidad replicativa de Mtb en macrófagos alveolares murinos de la línea celular MH-S. Asimismo, se comparó la virulencia de las cepas MtbΔctpF y MtbWT en un ensayo de sobrevida en ratones BALB/c, encontrando que los ratones infectados con la cepa mutante mostraban mayor tiempo medio de supervivencia, sugiriendo la atenuación de la cepa mutante. Finalmente, se comprobó la existencia de estrategias complementarias que permiten contrarrestar deficiencias en el transporte iónico mediado por las ATPasa tipo P en Mtb. En efecto, se encontró que la cepa MtbΔctpF sobreexpresa el gen ctpH frente a concentraciones tóxicas de Ca2+ y durante los procesos de infección in vitro. De manera similar, el mutante MtbΔctpH sobreexpresó el gen ctpF bajo condiciones tóxicas de Ca2+, sugiriendo una posible actividad compensatoria entre CtpF y CtpH en Mtb. En general, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que las Ca+2-ATPasas están involucradas en la respuesta frente sustancias tóxicas, siendo fundamentales para la supervivencia celular de Mtb. Además, CtpF es relevante para la proliferación intracelular, y su deleción genera atenuación del bacilo tuberculoso en un modelo experimental de TB pulmonar. De esta manera, CtpF es fundamental para la virulencia de Mtb, por lo que podría considerarse un interesante blanco de atenuación. (texto tomado de la fuente)

Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by the acid and alcohol-resistant bacillus Mycobacterium tuberculosis (Mtb). TB is considered a public health threat due to its high incidence, the emergence of drug-resistant strains (MDR and XDR), coinfection with HIV, and the limited efficacy of the BCG vaccine. Consequently, the design of new TB control strategies relies on a better comprehension of the molecular mechanisms used by Mtb to be a successful intracellular pathogen. In this sense, some studies have suggested that P-type ATPases are relevant to the physiology and intracellular survival of mycobacteria. Specifically, a meta-analysis of the transcriptional levels of Mtb P-type ATPases under conditions of hypoxia, oxidative stress, starvation, intoxication by chemical agents, and in vitro and in vivo infection processes indicated that these transporters are differentially expressed in these situations. Among the 12 P-type ATPases encoded in the Mtb genome, CtpF encodes a Ca2+ transporter and is the most activated against the conditions studied. Furthermore, several P-type ATPases (ctpF, ctpG, ctpC, ctpH, and ctpV) show over-expression during infection of human macrophages, suggesting the relevance of these proteins in the infection process. Therefore, the main objective of this study was to evaluate the effect of the deletion of alkali/alkaline earth metal-transporting P-type ATPases on the viability and virulence of Mtb. For this, recombination techniques were applied to construct mutants defective in the Mtb ctpF and ctpH genes that encode alkali/alkaline earth metal-transporting ATPases. Diverse functional analyses of these mutants demonstrated that both transporters are involved in Ca2+ efflux. Additionally, the mutant strains (MtbΔctpF and MtbΔctpH) showed hypersensitivity to oxidizing agents compared to the wild type strain (MtbWT), indicating a link between Ca2+ transport and the mechanism used by the bacillus to neutralize reactive species in the intraphagosomal environment. Moreover, the effect ctpF gene deletion on Mtb virulence was evaluated in cellular and animal infection models. Accordingly, this deletion generated a significant decrease in the replicative capacity of Mtb in murine alveolar macrophages of the MH-S cell line. Furthermore, a comparison of the virulence of MtbΔctpF and MtbWT strains through survival tests in BALB/c mice demonstrated that mice infected with the mutant strain showed a longer mean survival time, suggesting the attenuation of the deleted strain. Finally, the existence of a possible compensatory mechanism to counteract deficiencies in ion transport mediated by P-type ATPases in Mtb was evaluated. Indeed, the MtbΔctpF strain over-expresses the ctpH gene against toxic concentrations of Ca2+ and during in vitro infection processes. Similarly, the MtbΔctpH mutant over-expresses the ctpF gene under toxic concentrations of Ca2+, suggesting a possible compensatory activity between ctpF and ctpH in Mtb. This study demonstrates that Ca+2-ATPases are involved in the response to toxic substances, being essential for Mtb survival. Furthermore, CtpF is required for the intracellular proliferation of the mycobacteria, whereas its deletion attenuates the bacillus in an experimental model of pulmonary TB. Overall, CtpF is critical for Mtb virulence and can be an interesting attenuation target.