RNAs largos no codificantes (lncRNAs) de Passiflora edulis Sims f. edulis involucrados en la respuesta a déficit hídrico

Abstract

La respuesta transcripcional frente al déficit hídrico comprende una compleja red de interacciones moduladas de forma específica y temporal. Los lncRNAs son transcritos regulatorios que hacen parte importante de estos procesos, sin embargo, su función en la respuesta al déficit hídrico en Passiflora edulis f. edulis sigue siendo desconocida. Para aportar al conocimiento sobre el papel que los lncRNAs tienen durante la respuesta transcripcional de P. edulis f. edulis se realizaron tres aproximaciones: (1) estudio y caracterización de los lncRNAs a partir del transcriptoma; (2) análisis de su expresión y co- expresión y finalmente (3) validación experimental usando RT-qPCR. En una primera aproximación, se identificó y caracterizó la fracción de lncRNAs en Passiflora edulis f. edulis mediante el procesamiento bioinformático de librerías de RNA-seq. Este análisis se basó en un transcriptoma ensamblado, junto con anotaciones funcionales, estructurales y de elementos repetitivos. La identificación de los lncRNAs se realizó siguiendo criterios relacionados con la longitud de los transcritos, su potencial codificante y su contexto genómico. La caracterización abordó características moleculares, expresión diferencial en tejidos, similitud de secuencia con otros lncRNAs y presencia de elementos transponibles. Esto permitió la identificación de 34.206 lncRNAs, de los cuales 4.176 tienen expresión diferencial en tejidos, 10.212 presentan elementos transponibles dentro de su secuencia, y 821 tienen similitud de secuencia de más del 80% con otros lncRNAs reportados en plantas. Estos lncRNAs tienen una menor expresión en comparación con mRNAs, menor longitud, pero mayor especificidad de tejido según valores TAU. Estos resultados proporcionaron un set robusto de lncRNAs que demuestran la complejidad asociada al paisaje transcripcional no codificante en P. edulis f. edulis y es un insumo importante para posteriores estudios. En una segunda aproximación se evaluó el papel de estos 34.206 lncRNAs en la respuesta a déficit hídrico mediante análisis de expresión diferencial y análisis de redes de co-expresión con mRNAs. Para esto se usaron librerías de RNAseq de muestras en déficit hídrico a los 5 y 10 días, de hojas y raíces. Se obtuvieron 187 lncRNAs diferencialmente expresados en déficit hídrico, con una dinámica transcripcional y de regulación específica por tiempo y tejido. Los análisis de redes de co-expresión permitieron asociar lncRNAs en módulos relacionados con la señalización, modulación de la conductancia estomática, modulación del crecimiento, fotosíntesis y biosíntesis de metabolitos secundarios. El análisis de las regiones promotoras de estos lncRNAs y mRNAs, reveló la presencia de motivos de unión de factores de transcripción relacionados con familias de factores de transcripción involucrados en la respuesta al déficit hídrico, como Dof, ERF/AP2, B3, MIKC_MADS y BBR-BPC. Estos resultados podrían explicar la co-expresión de estos lncRNAs y mRNAs dentro de la respuesta a déficit hídrico. Finalmente, como tercera aproximación, se validó la expresión de lncRNAs y mRNAs de estos módulos mediante RT-qPCR en un nuevo experimento de déficit hídrico y una etapa de rehidratación. Los resultados permiten concluir que los lncRNAs identificados son reguladores putativos que, en conjunto con los mRNAs, hacen parte de las redes transcripcionales de respuesta al déficit hídrico. Estos transcritos se asocian a rasgos importantes dentro de la estrategia de evitación como la regulación sobre transporte de agua y la conductancia estomática. Estos resultados proporcionan información acerca de los mecanismos de respuesta innatos que poseen las plantas para responder al déficit hídrico y se presenta como un insumo para posteriores aproximaciones. (Texto tomado de la fuente)

The transcriptional response to water deficit involves a complex network of interactions that are modulated in a specific and transient manner. The long non-coding RNAs (lncRNAs) are regulatory transcripts that play an important role in these cellular processes, but their function in the response to water deficit in Passiflora edulis f. edulis remains unknown. To contribute to the knowledge of the role that lncRNAs play during the transcriptional response of P. edulis f. edulis, three approaches were taken: the study and characterization of lncRNAs in a transcriptome, the analysis of their expression and co-expression and, in the final approach, their validation by RT-qPCR. In the first approach, the fraction of lncRNAs in P. edulis f. edulis were identified and characterized through bioinformatic processing of RNAseq libraries, an assembled transcriptome, functional and structural annotation, and annotation of repetitive elements. lncRNAs were identified according to criteria related to transcript length, coding potential and genomic context. Characterization included molecular features, differential expression in tissues, sequence similarity to other lncRNAs and the presence of transposable elements. This allowed the identification of 34.206 lncRNAs, 4.176 of which display differential expression in tissues, 10.212 have transposable elements within their sequence, and 821 have sequence similarity of more than 80% with previously reported lncRNAs. These lncRNAs have lower expression compared to mRNAs, shorter length, but higher tissue specificity according to TAU values. These results provided a robust set of lncRNAs that demonstrate the complexity associated with the non-coding transcriptional landscape in P. edulis f. edulis and represents a valuable resource to test hypotheses related to their function. In the second approach, the role of these 34.206 lncRNAs in the response to water deficit was determined by differential expression analysis using RNAseq libraries of leaves and roots after 5 and 10 days of water deficit and an analysis of co-expression networks with mRNAs. Seven hundred differentially expressed lncRNAs were obtained, with transcriptional dynamics and specific regulation by time and tissue. Co-expression network analyses permitted the association of lncRNAs in modules related to signal transduction, modulation of stomatal conductance, modulation of growth, photosynthesis and biosynthesis of secondary metabolites. Analysis of the promoter regions of these lncRNAs and mRNAs revealed the presence of transcription factor binding motifs related to families of transcription factors involved in the response to water deficit, such as Dof, ERF/AP2, B3, MIKC_MADS, and BBR-BPC. These results could explain the co-expression of these lncRNAs and mRNAs within the response to water deficit, raising the possibility of a context of co-regulation between these transcripts. Finally, as a third approach, the expression of lncRNAs and mRNAs of these modules was validated by RT-qPCR in a new experiment of water deficit, where a rehydration stage was addressed. The result of this work shows that the identified lncRNAs are putative regulatory molecules that, together with mRNAs, are part of the transcriptional networks of response to water deficit. These transcripts are associated with important functions within the avoidance strategy, such as regulation of water transport and stomatal conductance. Overall, these results provide information about the innate response mechanisms that plants have to respond to water deficit and are presented as input for further approaches related to understanding the future persistence of populations in the face of reduced water availability.