Inmunodetección de las proteínas de la cascada de fosfoinositoles en células HEK293 y evaluación de los efectos del litio sobre corrientes de membrana activadas por esta vía

Abstract

El litio ha sido ampliamente utilizado como el principio activo en medicamentos psiquiátricos, pero el conocimiento de sus mecanismos de acción a nivel celular y molecular es limitado. Estudios bioquímicos han establecido que uno de los diversos blancos sobre los cuales podría actuar el litio es la vía de señalización de fosfoinositoles, pero se carece de estudios funcionales para comprobar esta hipótesis. Estudios previos en células sensoriales de anfioxo, que responden a la luz a través de la activación de esta vía revelaron un aumento robusto de la respuesta fisiológica ante la exposición aguda a litio extracelular en altas dosis. Para extender esta observación a un contexto clínicamente relevante y con el propósito de tener un mayor entendimiento de los efectos fisiológicos definidos del litio en células individuales, se propuso desarrollar un sistema apto para evaluar la modulación de las corrientes de membrana activadas por la vía de fosfoinositoles en células mamíferas en cultivo. Se realizaron ensayos de western blot e inmunofluorescencia para corroborar la expresión de los elementos clave de señalización de esta vía: M3-mAChR, Gq, PLCβ1 e IP3R-I en células HEK293, que de manera endógena expresa receptores muscarínicos acoplados a Gq. Para asegurar la presencia de una conductancia iónica acoplada a Gq y para corroborar la mediación de la vía de fosfoinositoles se realizaron registros de patch clamp activando la cascada por diálisis con GTP-γ-S y exponiendo las células a un antagonista de la fosfolipasa C, respectivamente. La estimulación de los receptores muscarínicos con carbacol, un análogo de la acetilcolina, produjo corrientes similares a las inducidas por GTP-γ-S, y la utilización de bajas concentraciones reveló corrientes de salida que se exacerbaron con la exposición aguda a litio. Basados en los resultados obtenidos, se propone la posibilidad de que se presenten dos poblaciones de receptores con diferente sensibilidad al carbacol y que el litio ejerza efectos diferenciales sobre ellos (Texto tomado de la fuente).

Lithium has been widely used as the active principle in psychiatric medications, but knowledge of its mechanisms of action at the cellular and molecular level is limited. Biochemical studies have established that one of the various targets on which lithium could act is the phosphoinositol signaling pathway, but functional studies are lacking to test this hypothesis. Previous studies in amphioxus sensory cells, that respond to light through the activation of this pathway revealed a robust increase in the physiological response to acute exposure to extracellular lithium in high doses. To extend this observation to a clinically more relevant context and with the purpose of having a better understanding of the defined physiological effects of lithium in individual cells, we proposed to develop a system suitable for evaluating the modulation of membrane currents activated by the phosphoinositol signaling pathway in mammalian cells in culture. Western blot and immunofluorescence assays were performed to corroborate the expression of the key signaling elements of this pathway: M3-mAChR, Gq, PLCβ1 and IP3R-I in HEK293 cells, which endogenously expresses muscarinic receptors coupled to Gq. To ensure the presence of an ionic conductance coupled to Gq and to corroborate the mediation of the phosphoinositol pathway, patch clamp recordings were performed by activating the cascade by GTP-γ-S dialysis and exposing the cells to a phospholipase C antagonist, respectively. Stimulation of muscarinic receptors with carbachol, an analog of acetylcholine, evoked similar currents to those induced by GTP-γ-S, and the use of low concentrations revealed outward currents that were exacerbated with acute lithium exposure. Based on the results, we propose the possibility of the existence of two populations of muscarinic receptors with different sensitivity to carbachol and that lithium exerts differential effects on them.