Bases moleculares de elementos de la cascada de señalización en fotorreceptores microviliares

Abstract

Las opsinas visuales animales han sido agrupadas, basándose en análisis de secuencias, en unas pocas categorías que se relacionan estrechamente con las principales clases morfológicas de fotorreceptores. En particular, las opsinas tipo R comprenden un amplio grupo de moléculas sensibles a luz encontradas en receptores visuales de artrópodos y moluscos, y receptores circadianos de vertebrados. Estas presumiblemente se acoplan a través de Gq a la cascada de fosfoinositidos; sin embargo los mecanismos efectores cuesta abajo permanecen controversiales, y evidencia en conflicto ha sido obtenida en diferentes especies. Las bases moleculares de esta vía de señalización han sido estudiadas sistemáticamente solo en Drosophila, por tanto surge la cuestión acerca de la posible divergencia entre especies y resalta la necesidad de una cobertura filogenética más amplia. Para llenar este vacío, se ha comenzado a identificar por PCR moléculas de señalización de luz putativas en fotorreceptores tipo R de filos ampliamente separados: los fotorreceptores microviliares del ojo de un molusco Pecten irradians y del tubo neural del cordado basal Anfioxo (Branchiostoma floridae). El transcriptoma de la retina de Pecten y el genoma de Anfioxo sirvieron como marco de trabajo para el diseño de primers, complementando criterios basados en homología. La búsqueda fue inicialmente enfocada en dos elementos de la fototransducción claves, la enzima regulada por luz y el potencial canal iónico activado por luz. Amplificaciones por PCR y extensión por RACE usando ADNc de la retina de Pecten permitieron obtener dos isoformas de PLC-β, mientras que un clon parcial de PLC fue obtenido en Anfioxo usando ADNc del tubo neural. De una búsqueda bioinformática, varios ortólogos de TRP tanto en Anfioxo como en Pecten fueron seleccionados como candidatos para la conductancia activada por luz. Dos TRPs fueron clonados en Anfioxo y un único TRP en Pecten. Anticuerpos contra péptidos de las secuencias de aminoácidos predichas y ribo-sondas fueron usadas para localizar su expresión por inmunocitoquímica e hibridación in situ respectivamente (Texto tomado de la fuente).

Animal visual opsins have been grouped, based on sequence analysis, into a few categories which closely follow the main morphological classes of photoreceptors. In particular, 'R-opsins' comprise a large group of light-sensing molecules found in visual receptors of arthropods and mollusks, and in circadian receptors of vertebrates. They presumably couple via a Gq to the phosphoinositide cascade; however, downstream effector mechanisms remain controversial, and conflicting evidence has been obtained from different species. The molecular underpinnings of this signaling pathway have been studied systematically only in Drosophila, raising questions about possible species divergence, and highlighting the need for a wider phylogenetic coverage. To help fill this gap, it has begun identifying by PCR putative light-signaling molecules in R-type photoreceptors from widely separate phyla: the microvillar photoreceptors from the eye of the mollusk Pecten irradians and the neural tube of the primitive chordate Amphioxus (Branchiostoma Floridae). The transcriptome of the Pecten retina and the Amphioxus genome provided a rational framework for primer design, complementing homology-based criteria. Search was initially focused on two key phototransducing elements, the light-regulated enzyme and potential lightactivated ion channels. PCR amplifications and RACE extensions using scallop retina cDNA yielded two PLC-β isoforms, while a partial PLC clone has been obtained in Amphioxus using neural tube cDNA. From a bioinformatics search, several Amphioxus and Pecten TRP orthologs were selected as candidates for the light-sensitive conductance. Two TRPs were cloned in Amphioxus and a single TRP in Pecten. Antibodies against peptides from the predicted aminoacid sequences and riboprobes were used to localize their expression by immunohistochemistry and in situ hybridization, respectively.