Estudios de secreción de IL-12 en macrófagos J774A.1

Abstract

El tráfico de membranas en macrófagos activados es requerido para dos eventos críticos en la inmunidad innata, como son fagocitosis y secreción de citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, no existe evidencia significativa a cerca de las rutas de secreción en macrófagos, excepto para IL-1 β (Andrei et al., 2004) y TNF-a, en infección por Cándida albicans (Murray et al., 2005) y Leishmania amazonensis (Montoya, 2010), a diferencia de la secreción en células endocrinas y neuroendocrinas donde la evidencia es muy amplia. Por lo tanto, ésta propuesta está basada en el convencimiento que sólo una comprensión adecuada de la secreción de mediadores químicos por parte del macrófago permitirá determinar qué respuestas son o no específicas de la infección por Leishmania. Se evaluaron la secreción de IL-12p70 en sobrenadantes de cultivo de macrófagos de la línea celular J774A.1 por ensayos de citometría de flujo, la localización y distribución de IL-12p40/ 70 y p40 por microscopía confocal en diferentes grupos experimentales: macrófagos activados con INF y LPS, infección por Leishmania y fagocitosis de partículas de látex que generan diferentes tamaños de fagosoma (28 μm3, 136 μm3 similar a la infección 48hpi y fagosomas grandes 370μm3), para determinar el impacto del volumen del fagosoma sobre localización, distribución y secreción de IL-12. Nuestros resultados muestran que IL-12 no se produce de manera constitutiva en macrófagos J774A.1; se produce de manera regulada, inducida por estímulo conINF-g y LPS. L. amazonensis, induce disminución de la producción de IL-12p70 y desactivación en macrófagos estimulados con INF-g y LPS. IL-12p40/70 es retenida en compartimentos del RE-Golgi y compartimentos endolisosomales donde colocaliza con marcadores como CALNEXINA, SNAP-23 y LAMP-1 respectivamente. La colocalización de IL-12 con estos marcadores, sugiere exocitosis de esta proteína mediada por: 1. vesículas secretoras por la ruta de secreción biosintética, 2. Lisosomas secretorios por la ruta endocítica, y 3. Exocitosis por fusión directa del RE con la MP. INF-g y LPS inducen la producción de IL-12p40 en fagocitosis de partículas de látex y, ésta es retenida a nivel perifagosomal, sin secreción del heterodímero p70. Estos resultados sugieren que la producción de IL-12 es parásito-inespecífica y que la inhibición de la secreción de IL-12 en fagocitosis puede ser el resultado del impacto del volúmen, donde fagosomas de gran tamaño de Leishmania o partículas de látex, retienen un pool intracelular de IL-12p40/70 con efectos en la exocitosis del heterodímero p70.

Abstract. The membrane traffic in activated macrophages is required for critical events associated with innate immunity, like phagocytosis of pathogens and secretion of cytokines. The intracellular trafficking and secretion pathways of many of the proinflammatory cytokines has not been elucidated, except in the cases of IL-1 beta (Andrei et al., 2004) and TNF-α (Murray et al., 2005). Therefore, the secretory pathway of the proinflammatory cytokine IL-12, link between innate and adaptive immune response, was studied in the macrophage-cell line J774.A1 in different functional stages (rest, after phagocytosis and after classical activation) as well as after infection with the human pathogen Leishmania amazonensis. Secretion of IL-12p70 was evaluated by flow cytometry and localization and distribution of IL-12p40/70 and p40 by confocal microscopy. The results found show that IL-12 is not constitutively secreted and activation of the macrophage with INF-γ and LPS is required for its secretion. Infection with L. amazonensis deactivates macrophages and causes retention of this cytokine in compartments of the RE-Golgi and endocytic compartments where it co-localizes with the markers Calnexin, SNAP-23 and LAMP-1 respectively. This co-localization, suggests exocitosis of this protein by multiple pathways:1. Secretory vesicles by the biosyntetic secretory route, 2. Endocytic route by secretory lysosomes, and 3. Exocytosis by direct fusion of the ER with the PM. A similar result was found after phagocytosis of loads that generated pahgosomes of a volume equivalent to that of L. amazonensis infection, induced retention of IL-12 at periphagosomal level, without secretion of the p70 heterodimer. These results suggest that large loads inside the macrophage promote retention of IL-12 therefore explaining lower secretion levels independent of the nature of the particle phagocytosed by the macrophage.