Obtención de un equivalente dérmico mediante la proliferación en biorreactor de fibroblastos sobre microportadores fabricados con geles de plasma sanguíneo humano y alginato de sodio

Abstract

Una alternativa para resolver la pérdida de piel es el empleo de equivalentes dérmicos. Con miras a generar un equivalente dérmico, este trabajo inició con la formación de geles de plasma sanguíneo humano mezclado con alginato de sodio al 0.8 % y 1.6 % de alginato de sodio, entrecruzado con diversas soluciones de cloruro de calcio (1%, 2% y 3%). Mediante reología dinámica y ensayos mecánicos, se determinó que la concentración que permitía un gel más resistente era al 1.6% de alginato, entrecruzado con cloruro de calcio al 3% p/v. Una mezcla de plasma/alginato al 1.6 % p/v fue descargada a través de una boquilla coaxial sobre una solución de cloruro de calcio (3% p/v), para generar microesferas cuyo diámetro se encontrara entre 150 μm y 500 μm. Con miras a aumentar la adhesión celular, se adsorbió en la superficie de las microesferas poli-l-lisina y fibrinógeno entrecruzado con trombina. Sobre estos microportadores, se realizó el cultivo de fibroblastos murinos de la línea 3T3 y humanos en un reactor spinner. Gracias al cultivo en biorreactor se logró reducir el tiempo de duplicación de los fibroblastos, comparado con el tiempo en caja de microtécnica. Los fibroblastos humanos fueron atrapados en geles de plasma/alginato pero dichos geles no fueron estables y ello ocasionó la pérdida de viabilidad a través del tiempo; por lo cual se evaluó en un gel de crioprecipitado entrecruzado con cloruro de calcio al 3% p/v. La viabilidad y proliferación se mantuvieron por 15 días sin que se desintegrara el gel. No se evidenció la formación de redes de colágeno.

Abstract. An alternative in order to solution to the loss of skin is by dermal equivalents. For generation a dermal equivalent, in this work started from the formation of human blood plasma mixed with sodium alginate and crosslinked with different calcium chloride solutions (1%, 2% and 3%). Dynamic rheology and mechanical test revealed that the maximum strength of the gel obtained was achieved for a combination of 1.6% alginate, crosslinked with calcium chloride at 3% w/v. A mixture of plasma/alginate at 1.6% w/v was discharged across a coaxial nozzle over a calcium chloride solution (3% w/v) in order to generate microspheres with diameter between 150- 500 μm. In order to enhance the cellular adhesion, adsorption of poli-l-lisine and fibrinogen crosslinked with thrombine was developed under the surface of microspheres. Upper these microcarriers murine fibroblast (3T3) and human fibroblasts was performed in a spinner reactor. Results of culture in the bioreactor shows that the time for the duplication of fibroblasts was reduced significantly compared with the equivalent in petri dishes. Human fibroblast were encapsulated in plasma/alginate gels, but they were not stable along time, causing a corresponding loss in viability cellular. Due to that, gels were fabricated using cryoprecipitated crosslinked with calcium chloride at 3% w/v. The viability and proliferation of fibroblasts were maintained during 15 days without observable gel disintegration. Formation of collagen network was not observed.