Evaluación de la actividad antimicrobiana de extractos obtenidos de BAL aisladas de queso doble crema y quesillo sobre el crecimiento in vitro de Salmonella spp. Y Listeria monocytogenes

Abstract

En los últimos años, ha existido un enfoque particular, en la aplicación de compuestos antimicrobianos producidos por Bacterias Ácido Lácticas (BAL), como conservantes naturales, para controlar el crecimiento de microorganismos patógenos y deteriorantes de los alimentos. Dentro de estos compuestos se encuentran péptidos antimicrobianos llamados bacteriocinas, que pueden añadirse a los alimentos, en forma concentrada (aditivos) o pueden ser producidos in situ, como cultivos iniciadores o protectores. El objetivo de esta investigación fue evaluar la capacidad antimicrobiana de BAL autóctonas aisladas de queso doble crema y quesillo, frente al crecimiento in vitro de Salmonella entérica subsp. entérica serovar Typhimurium ATCC 13311 y Listeria monocytogenes ATCC 7644. Se estudiaron 32 aislados identificados previamente, mediante el análisis de secuencias del gen 16S DNAr y caracterizados tecnológicamente, comprobando su capacidad antimicrobiana, a través de la técnica de la mancha en agar. Posteriormente, se obtuvieron sobrenadantes libres de células, se neutralizaron y filtraron para detectar su actividad antimicrobiana mediante el método de difusión en gel por perforación en placa. Se seleccionaron los ocho (8) aislados que demostraron capacidad inhibidora frente a los dos (2) microorganismos patógenos, los cuales fueron sometidos a diferentes condiciones de pH (4.0, 7.0, 10.0); temperatura (60°C/15 min., 60°C/30 min., 80°C/15 min. y 80°C/30 min.) y enzimas proteolíticas (proteinasa K). Las sustancias antimicrobianas de los aislados identificados como Lactococcus lactis subsp. lactis (Q5), Lactobacillus fermentum (Q6), Enterococcus lactis (Q7), Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (Q12) y Lactobacillus casei (QDC31) fueron concentradas y cuantificadas y se determinó su peso molecular, a través de una Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (SDS- PAGE). El sobrenadante libre de células del aislado identificado como Lactococcus lactis subsp. lactis (Q5) presentó una actividad superior, equivalente a 64.000 UA/mL para L. monocytogenes y 4.000 UA/mL para S. typhimurium y su sustancia antimicrobiana concentrada presentó una banda con un peso molecular 3.5 KDa. Los ocho (8) sobrenadantes libres de células exhibieron actividad antimicrobiana cuando fueron tratados a un pH de 7 y presentaron sensibilidad a la enzima proteolítica utilizada, al igual que a la mayoría de los tratamientos térmicos evaluados. El extracto de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides presentó la mayor concentración de proteína total y las mayores Unidades de Actividad, para los dos patógenos evaluados. Se sugiere que las BAL provenientes de quesos tradicionales colombianos tienen la capacidad de producir sustancias antimicrobianas, con potencial bactericida y pueden ser utilizadas en la formulación de un cultivo iniciador, con efecto bioprotector.

Abstract: In recent years, there has been a particular focus on the application of antimicrobial compounds produced by lactic acid bacteria (LAB) as natural preservatives to control the growth of pathogenic and / or spoilage microorganisms in food. Within these compounds are antimicrobial peptides called bacteriocins may be added to foods in concentrated forms (additives) or may be produced in situ as starter cultures or protectors. The objective was to evaluate the antimicrobial capacity of native BAL isolated from Double Cream Cheese and Quesillo against the in vitro growth of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 13311 and Listeria monocytogenes ATCC 7644. We studied 32 isolates, previously identified by analysis of 16S rDNA gene sequences and characterized technologically. We tested antimicrobial capacity using an agar spot test. Subsequently, cell-free supernatants were neutralized and filtered to detect their antimicrobial activity using the gel diffusion method by drilling plate. We selected 8 isolates showing inhibitory capacity against the two pathogens microorganisms, which were subjected to different conditions of pH (4.0, 7.0, 10.0); temperature (60 ° C/15 min, 60 ° C/30 min, 80 ° C/15 min and 80 ° C/30 min) and proteolytic enzymes (Proteinase K). The antimicrobial substance identified as Lactococcus lactis subsp. lactis (Q5), Lactobacillus fermentum (Q6), Enterococcus lactis (Q7), Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (Q12) and Lactobacillus casei (QDC31) was concentrated and quantified and its molecular weight was determined through a Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). The cell-free supernatant isolated identified as Lactococcus lactis subsp lactis (Q5) presented higher activity, equivalent to 64.000 AU/ml for L. monocytogenes and 4,000 AU / ml for S. typhimurium. All cell-free supernatants showed antimicrobial activity when treated at pH 7 and showed sensitivity to proteolytic enzyme, like most of the heat treatments evaluated. The extract Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides (Q12) had the highest concentration of total protein and higher activity units for both pathogens. Isolated identified as Lactococccus lactis subsp. lactis showed a band with a lower molecular weight of 3.5 KDa (Q5). It is suggested that BAL from traditional cheeses Colombian has the ability to produce antimicrobial substances with bactericidal potential and can be used in formulating a starter culture with bioprotective effect.