Análisis de balance de flujo dinámico de la producción de 1,3-Propanodiol a partir de Clostridium sp

Abstract

Resumen El incremento en el glicerol obtenido como coproducto del biodiesel ha incentivado la producción de nuevos productos industriales como el 1,3-propanodiol (PDO) mediante transformación biotecnológica usando bacterias como Clostridium butyricum. Ahora bien, a pesar del creciente interés de este proceso de bioproducción, el metabolismo de Clostridium butyricum prácticamente no ha sido modelado. Por lo tanto, fue reconstruido el primer modelo metabólico de escala genómica (modelo GSM) de una cepa de Clostridium productora de PDO (iCbu641), el cual contiene 641 genes, 365 enzimas, 891 reacciones y 701 metabolitos. Fue lograda una predicción en la expresión de enzimas del 83% después de comparación entre datos de proteomica y distribución de fluxes predichos mediante Análisis de Balance de Flujo (FBA). Las restantes enzimas no predichas están direccionalmente acopladas al crecimiento de acuerdo a la Búsqueda de Fluxes Enlazados (FCF) y muchas de ellas están involucradas en procesos que el FBA no puede anticipar, tales como mecanismos de regulación celular. En adición, durante la validación usando datos de fermentación en estado estacionario, diferentes estados fenotípicos fueron observados dependiendo de la concentración de glicerol, los cuales fueron predichos mediante diferentes funciones objetivo. Posteriormente, fue desarrollada una aproximación dinámica que fue validada experimentalmente mediante cultivos de la cepa nativa Clostridium sp. IBUN 158B. Además fue realizado análisis de sensibilidad detectando que la restricción cinética de consumo de glicerol fue el principal parámetro que afectó la predicción de PDO producido. Los restantes parámetros evaluados en el análisis de sensibilidad fueron empleados en el desarrollo de un modelo segregado, el cual permitió predecir comportamientos poblacionales. Por otra parte, perturbaciones en el modelo GSM fueron realizadas mediante deleciones de enzimas, sin embargo ninguna mutante evaluada tuvo incrementos significativos en la producción de PDO, lo cual es debido a que el PDO es un metabolito primario y su producción también es optimizada por el FBA. Seguidamente, simulaciones dinámicas adicionales fueron realizadas con el objetivo de predecir cultivos por lote alimentado, permitiendo mejorar la producción de PDO de 23.5 hasta 66g/L. Finalmente, gracias a que los valores predichos estuvieron de acuerdo con valores experimentales, es posible sugerir que el modelo reconstruido puede ser empleado para proponer nuevos escenarios y por tanto reducir tiempo y costos asociados a la experimentación. ///

Abstract. The increase of glycerol obtained as a byproduct of biodiesel has encouraged the production of new industrial products such as 1,3-propanediol (PDO) using biotechnological transformation via bacteria like Clostridium butyricum. Despite this increasing role as bio-production platforms, Clostridium butyricum metabolism remains poorly modeled. Herein, it was reconstructed the first genome-scale metabolic (GSM) model of a PDO producer Clostridium strain (iCbu641), which contains 641 genes, 365 enzymes, 891 reactions and 701 metabolites. It was found an enzyme expression prediction near to 83% after comparison between proteomic data and flux distribution estimated using Flux Balance Analysis (FBA). The remaining unpredicted enzymes are directionally coupled to growth according to Flux Coupling Finding (FCF) and many of them are involved in processes that FBA cannot anticipate as cellular regulatory mechanisms. Additionally, in the validation using steady state fermentation data, different phenotypes states were observed depending glycerol concentration, which were predicted using different objective functions. Also, a dynamic approach was developed and validated experimentally through cultures of the native strain Clostridium sp IBUN 158B. Furthermore, sensitivity analyses were made detecting the kinetic constraint of glycerol uptake as the main parameter affecting the PDO prediction. The remaining parameters considered in the sensitivity analysis were employed to develop a segregate model, which allowed predicting population behavior. Moreover, perturbations in GSM through enzyme deletions were evaluated, however no significant increase in PDO production was predicted, which is due PDO is a primary metabolite and its production is optimized by FBA. Additional dynamic simulations were made in order to predict fedbatch cultures, allowing to enhance the PDO produced from 23.5 up to 66g/L. Finally, the agreement between predicted and experimental values allows to propose new scenarios using the model reconstructed and therefore reducing time and costs associated to experimentation.