La caña de azúcar es un cultivo importante en Colombia, intensivamente cultivado en el valle del río Cauca en cerca de 237.070 hectáreas. Para alcanzar altas productividades, se aplican altas y algunos casos excesivas dosis de fertilizantes nitrogenados, incrementando los costos de producción y agudizando los efectos ambientales. En la búsqueda de estrategias para reducir las aplicaciones de N dentro de un manejo integrado del cultivo, el uso de bacterias fijadoras de N está siendo explorado. Así entonces, el objetivo de este estudio fue aislar y caracterizar bacterias nativas fijadoras de N y promotoras de crecimiento pertenecientes a los géneros Azospirillum, Azotobacter y Gluconoacetobater en cuatro variedades comerciales sembradas en el valle del río Cauca (CC85-92, CC84-75, CC93-4418 y CC01-1940), en 108 lotes o suertes seleccionados para este estudio. Las muestras fueron compuestas a partir de 20 plantas (tallos, hojas, raíces y suelo rizosférico) por sitio, seleccionadas aleatoriamente, para un total de 2.160 plantas, las cuales se transportaron y procesaron en el Laboratorio de Fitopatología de CENICAÑA. De los extractos vegetales se inocularon los medios de cultivo selectivos LGI-P, Ashby y NFB para realizar el aislamiento y caracterización para cada género. Se obtuvieron 111 aislamientos caracterizados morfológica y bioquímicamente agrupados con base en pruebas por triplicado para α and β-proteobacterias, incluyendo aerobiosis/microaerofílicos, motilidad, tinción de Gram, metabolismo oxidativofermentativo y metabolismo de diferentes carbohidratos y sales orgánicas. De los 111 aislamientos, se identificaron molecularmente 15 aislamientos bacterianos del género Azospirillum spp., 32 aislamientos del género Gluconacetobacter spp. y 20 aislamientos del género Azotobacter spp. mediante secuenciación del gen 16S del ADN ribosomal. La cuantificación de ácido 3-indol acético y reducción de acetileno mostró diferencias significativas en producción de fitohormonas y en la eficiencia de la fijación de nitrógeno, obteniendo cinco cepas bacterianas (Números 2, 14, 16, 21 y 24) que presentaron una alta capacidad fijadora de nitrógeno y producción de compuestos indólicos con respecto a las cepas de referencia de Azotobacter chroococcum NCBIM 8002, Azospirillum brasilense NCBIM 11860, Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985. La secuenciación y alineamiento del gen nifH para muestras contrastantes de algunos de estos aislamientos no presentó variantes genéticas entre los aislamientos con mayor fijación biológica de nitrógeno, indicando una alta conservación de este gen. Se identificaron 14 aislamientos de los tres géneros como candidatos promisorios para trabajos y estudios futuros.//Abstract: Sugarcane is an important crop in Colombia, intensively planted in nearly 237,070 hectares along the Cauca’s river valley. To reach profitable yields, high and in some cases excessive nitrogen (N) fertilizers are applied, increasing production costs and risks for environmental and water contamination. Looking for strategies to reduce N applications within a sustainable and integrated crop management, the use of N-fixing bacteria is being explored. The objective of this study is to isolate and characterize native cultures of three recognized N-fixing bacteria and plant growth promoter genera such as Azospirillum, Azotobacter, and Gluconoacetobater, associated to CC 85-92, CC 84-75, CC 93-4418, and CC 01-1940 varieties, which are widely planted in this region. To cover most environments along the valley, 108 fields were selected to take composed samples from roots, stems, leaves, and rhizospheric soil from 20 plants randomly selected per field, for a total of 2,160 plants in this study. Samples were processed at CENICAÑA’s Plant Pathology Lab, plating on selective culture media LGI-P, Ashby, and NFB, among others for each bacteria genus. 111 isolates were morphologically and biochemically characterized based on triplicated tests for α and β-proteobacteria, including aerobic/microaerophilic, motility- helical-shaped rods and cocci, Gram stain, and oxidative-fermentative metabolism of different carbohydrates and organic salts. Out of 111 isolates, were identified 15 isolates for Azospirillum spp., 32 for Gluconacetobacter spp. y 20 isolates for Azotobacter spp. By sequencing of 16S ribosomal DNA. Quantitation of Indole-3 Acetic Acid as growth promoting substance and acetylene reduction as nitrogen fixation indicator, showed significant differences between genera and isolates, obtaining five isolates (Numbers. 2, 14, 16, 21 and 24) with high N- fixing and indolic compounds producing capability and efficiency in comparison to reference published isolates type cultures of Azotobacter chroococcum NCBIM 8002, Azospirillum brasilense NCBIM 11860, Gluconacetobacter diazotrophicus NCBIM 12985, among other bacteria. Sequencing and alignment of nifH gene region for contrasting samples of several of these isolates did not show genetic differences between isolates with higher nitrogen fixation efficiency, indicated high conservation of this gene. Fourteen isolates from the three genera were identified as promising candidates for further studies.