Caracterización de Dematophora spp. y desarrollo de una técnica isotérmica LAMP para el diagnóstico de Ceratocystis sp. y Dematophora sp. en cacao (Theobroma cacao L.)
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Resumen
El mal del machete o marchitamiento vascular causado por Ceratocystis cacaofunesta y la pudrición negra de la raíz por Dematophora spp. (sin. Rosellinia spp.), se han convertido en enfermedades de gran relevancia en los cultivos de cacao (Theobroma cacao L.), ya que la sintomatología se manifiesta típicamente en etapas avanzadas de la infección. Pese a su importancia, en Colombia se tienen escasos estudios de caracterización de aislamientos de Dematophora sp. asociados al cacao. Esto limita la comprensión de su diversidad y dificulta el desarrollo de métodos diagnósticos específicos. A esto se suma la escasez de técnicas de detección temprana de estos dos patógenos, lo que conlleva a emplear procedimientos tradicionales que demandan tiempos prolongados y equipos especializados de alto costo. Debido a ello, las herramientas moleculares como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) podría utilizarse como un método rápido y sensible de diagnóstico, incluso en material vegetal asintomático. Por ende, esta investigación tuvo como objetivo caracterizar aislamientos de Dematophora sp. y diseñar una prueba LAMP para la detección temprana de Ceratocystis sp. y Dematophora sp. en cacao. Se realizó la caracterización de 17 aislamientos de Dematophora sp. provenientes de cuatro regiones cacaoteras de Colombia. A nivel morfológico se evaluaron características macro y microscópicas y se hizo un análisis de componentes principales y factorial de datos mixtos para hacer agrupaciones. A nivel molecular se hizo un análisis filogenético multilocus usando las regiones ITS y LSU y los genes βT y RPBII para identificar los aislamientos a nivel de especie. Posteriormente, se realizó el diseño de cebadores LAMP para la detección de Ceratocystis sp. y Dematophora sp., determinando la especificidad y sensibilidad de la prueba. Se realizaron pruebas de patogenicidad de C. cacaofunesta y Dematophora spp. en plántulas susceptibles de cacao CNN-51 e IMC-67 respectivamente. Como resultados, con el análisis de las características morfológicas de los aislamientos de Dematophora sp. se obtuvieron cinco grupos morfológicos contrastantes. A nivel molecular se encontró que doce de los aislamientos se identifican como Dematophora pepo. Con la estandarización de la prueba LAMP se logró realizar la detección temprana de Ceratocystis sp. y Dematophora sp. en plántulas de cacao, con un límite de detección de 0,005 ng/µL y 0,0005 ng/µL respectivamente, siendo 1000 veces más sensible que una PCR de punto final. Con este estudio se aportan nuevos conocimientos a nivel morfológico, molecular y epidemiológico de las especies del género Dematophora que afectan al cacao en Colombia, al igual que nuevas herramientas de detección molecular isotérmicas para el diagnóstico temprano de patógenos vasculares y radicales de cacao. (Texto tomado de la fuente)
Abstract
Machete disease and black root rot, caused by Ceratocystis cacaofunesta and Dematophora spp. (sin. Rosellinia spp.), respectively, have become highly relevant diseases in cacao (Theobroma cacao L.) crops, as symptoms typically appear in advanced stages of infection. Despite their importance, few studies have characterized Dematophora sp. isolates associated with cacao in Colombia. This limits our understanding of their diversity and hinders the development of specific diagnostic methods. Furthermore, the scarcity of early detection tools of these two pathogens has led to the use of traditional procedures that require lengthy processes and expensive, specialized equipment. Therefore, molecular tools such as loop-mediated isothermal amplification (LAMP) can be used as a rapid and sensitive diagnostic method, even in asymptomatic plant material. Thus, this study aimed to characterize Dematophora sp. isolates and design a LAMP test for the early detection of Ceratocystis sp. and Dematophora sp. in cacao. Seventeen Dematophora sp. isolates from four cacao-growing regions in Colombia were characterized. At the morphological level, macro and microscopic characteristics were evaluated, and principal component and factorial mixed data analyses were performed to group the isolates into clusters. At the molecular level, multilocus phylogenetic analysis was conducted using the ITS and LSU regions and βT and RPBII genes to identify the isolates at the specie level. Subsequently, LAMP primers were designed for the detection of Ceratocystis sp. and Dematophora sp., and the specificity and sensitivity of the tests were determined. Pathogenicity tests with C. cacaofunesta and Dematophora spp. were performed on susceptible cacao seedlings using CCN-51 and IMC-67, respectively. Morphological analysis of the Dematophora sp. isolates revealed five distinct morphological groups. At the molecular level, 12 isolates were identified as Dematophora pepo. Standardization of the LAMP assay enabled the early detection of Ceratocystis sp. and Dematophora sp. in cacao seedlings, with detection limits of 0,005 ng/µL and 0,0005 ng/µL, respectively, making it 1000 times more sensitive than endpoint PCR. This study provides novel morphological, molecular, and epidemiological knowledge on Dematophora species affecting cacao in Colombia, as well as new isothermal molecular detection tools for the early diagnosis of vascular and root pathogens of cacao.
Descripción
ilustraciones a color, diagramas, fotografías, tablas