Identificación de una enzima involucrada en el metabolismo del NAD+ en Leishmania braziliensis, la nicotinato fosfo-ribosil transferasa (LbNAPRT)

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dc.contributor.advisorRamírez Hernández, María Helena
dc.contributor.authorGutiérrez Gutiérrez, Cristian Alirio
dc.contributor.cvlacGutiérrez Gutiérrez, Cristianspa
dc.contributor.googlescholarGutiérrez Gutiérrez, Cristianspa
dc.contributor.orcidGutiérrez Gutiérrez, Cristianspa
dc.contributor.researchgateGutiérrez Gutiérrez, Cristianspa
dc.contributor.researchgroupLaboratorio de investigaciones básicas en bioquímica (LIBBIQ)spa
dc.contributor.scopusGutiérrez Gutiérrez, Cristianspa
dc.date.accessioned2023-06-27T16:34:13Z
dc.date.available2023-06-27T16:34:13Z
dc.date.issued2023-02-08
dc.descriptionilustraciones, fotografíasspa
dc.description.abstractLa leishmaniasis es una enfermedad causada por el parásito protozoario del género Leishmania que, en países como Afganistán, Argentina, Colombia, Brasil, Irán, Siria, Etiopía, Sudan del norte, Costa Rica y Perú representan el 75 % del índice de prevalencia [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) reportó un total de 1.5 millones de nuevos casos en 102 países incluyendo Colombia. En la actualidad los medicamentos utilizados para el tratamiento de esta parasitemia como los antimoniales pentavalentes causan diversos efectos secundarios por lo cual, es necesario identificar nuevos blancos farmacológicos efectivos [2]. De esta forma el metabolismo energético podría ser considerado relevante en la búsqueda de posibles dianas farmacológicas, ya que es esencial para el mantenimiento de la integridad celular del protozoario [3]. En este contexto la nicotinato fosfo-ribosil transferasa (NAPRT) es una proteína de interés, debido a que determina los niveles de NAD+ intracelular. La NAPRT es la proteína encargada de sintetizar el mononucleótido de ácido nicotínico (NAMN) a partir del ácido nicotínico (NA) y la 5-fosfo-α- D -ribosa 1-difosfato (PRPP), siendo esencial en la vía de Preiss-Handler al regular los niveles del NAD+ en el parásito. En este trabajo se identificó la NAPRT en Leishmania braziliensis (LbNAPRT). Al analizar la secuencia in silico se observaron características asociadas a la interacción con los sustratos, regiones de posible oligomerización y de regulación alostérica. El análisis experimental se llevó a cabo mediante la generación de la proteína recombinante (LbNAPRT6xHis) en el sistema heterólogo E.coli. Se partió de ADN genómico de promastigotes de L. braziliensis para amplificar la secuencia codificante y construir el vector recombinante pET-22b+LbNAPRT. La proteína obtenida se empleó para el estudio de su funcionalidad en ensayo enzimático directo. A partir de la producción de proteína recombinante en el sistema heterólogo de E.coli se generó una herramienta inmunológica en modelo aviar, contra la LbNAPRT6xHis. Adicionalmente se realizaron ensayos de western blot e inmunofluorescencia para determinar la localización intracelular de la proteína, la cual presenta una ubicación a nivel citoplasmático en el estadio promastigote del parásito. Los resultados obtenidos constituyen un paso importante en el metabolismo del NAD, ya que se logró identificar funcionalmente la nicotinato fosfo-ribosil transferasa de Leishmanian braziliensis, esencial para la síntesis de los precursores del NAD+, como la primera NAPRT en protozoarios de importancia en la salud pública. (Texto tomado de la fuente)spa
dc.description.abstractLeishmaniasis is a disease caused by the protozoan parasite of the genus Leishmania which, in countries such as Afghanistan, Argentina, Colombia, Brazil, Iran, Syria, Ethiopia, North Sudan, Costa Rica and Peru represent 75% of the prevalence rate [1]. The World Health Organization (WHO) reported a total of 1. 5 million new cases in 102 countries including Colombia. Currently, the drugs used for the treatment of this parasitaemia, such as pentavalent antimony drugs, cause various side effects, so it is necessary to identify new effective pharmacological targets [2]. In this way, the energy metabolism could be considered relevant in the search for possible pharmacological targets, since it is essential for the maintenance of the cellular integrity of the protozoan [3]. In this context, nicotinate phosphoribosyl transferase (NAPRT) is a protein of interest because it determines intracellular NAD levels. NAPRT is the protein responsible for synthesizing nicotinic acid mononucleotide (NAMN) from nicotinic acid (NA) and 5-phospho-α-D -ribose 1-diphosphate (PRPP), being essential in the Preiss-Handler pathway by regulating NAD+ levels in the parasite. In this study NAPRT was identified in Leishmania braziliensis (LbNAPRT). When analyzing the in silico sequence, characteristics associated with the interaction with the substrates, regions of possible oligomerization and allosteric regulation were observed. The experimental analysis was performed by generating the recombinant protein (LbNAPRT6xHis) in the heterologous E. coli system. Genomic DNA from promastigotes of L. braziliensis was used to amplify the coding sequence and construct the recombinant vector pET-22b+LbNAPRT. From the production of recombinant protein in the heterologous system of E. coli, an immunological tool against LbNAPRT6xHis was generated in an avian model. Additionally, western blot and immunofluorescence assays were performed to determine the intracellular localization of the protein, which is located at the cytoplasmic level in the promastigote stage of the parasite. The results obtained constitute an important step in NAD metabolism, since it was possible to functionally identify the nicotinate phosphor-ribosyl transferase of Leishmania braziliensis, essential for the synthesis of NAD+ precursors, as the first NAPRT in protozoa of public health importance.eng
dc.description.degreelevelMaestríaspa
dc.description.degreenameMagíster en Ciencias - Bioquímicaspa
dc.description.methods6.2.4 Expresión de la proteína recombinante El vector recombinante pET-22b+LbnNAPRT se expresó en el sistema heterólogo de E. coli BL21 (DE3), las células se recuperaron en medio SOC e incubaron durante 1 hora a 37°C. Las células se dejaron crecer en medio Luria Broth (LB) en una dilución de 1:50 (cultivos), suplementado con Ampicilina 100µg/mL a 37°C en agitación constante (100 rpm) hasta alcanzar O.D 600nm de 0.6; la expresión se indujo con Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0.5mM, durante periodos de 2 horas a 25°C, como se estableció tras la optimización de estas condiciones. La expresión se monitoreo mediante SDS–PAGE y western blot usando αHisx6 (1:5000) y revelado con α mouse-Fosfatasa alcalina (1:10000). Las bacterias fueron centrifugadas a 6000 rpm/ 15min y el pellet obtenido fue tratado con buffer de lisis (50 mM Fosfato de potasio, pH 7.8, 400 mM NaCl, 100 mM KCl, 10% Glicerol, 0,5% TritonX 100, 10 mM Imidazol) se usó 5mL / gramo de pellet húmedo celular, 1mg/mL lisozima y 1:400 Inhibidor de proteasas. Se incubó la mezcla a 4°C durante 1 hora. Posteriormente la muestra se sónico a (50% amplitud, pulsos de 15s y reposo de 45s durante 3min) en baño de hielo. Se centrifugó a 12000 rpm. por 20 min a 4°C (rotor Microliter 30x2 sealed 75003652 ThermoFisher, Heraeus Megafuge 16R 75004271 ThermoFisher), separando las fracciones solubles e insolubles. Estos extractos fueron analizados mediante SDS-PAGE y western blot revelado con BCIP y NBT [43]. 6.2.5 Purificación de la proteína LbNAPRT por cuerpos de inclusión La fracción insoluble de la lisis se homogenizó con buffer de lavado 1 (Tris-HCl 100mM pH 7.0, EDTA 5mM, Ditiotreitol 5mM, Urea 2M y Triton X-100 al 2%) 5mL por cada gramo de células húmedas, luego se centrifugó a 12000rpm durante 30min, este procedimiento se repitió 3 veces. El pellet obtenido se homogenizó nuevamente con buffer de lavado 2 (Tris-HCl 100mM pH 7.0, EDTA 5mM y Ditiotreitol 5mM) y centrifugó a las mismas condiciones. Finalmente, se resuspendió con el buffer de extracción (Tris-HCl 50mM pH 7.0, EDTA 5mM, Ditiotreitol 5mM y guanidina-HCl 8M) y se centrifugó a 14000rpm durante 1 h. El sobrenadante se recuperó y dializó a 4°C durante 16 horas en buffer Tris-HCl 50mM y NaCl 150mM, empleando una membrana (MWCO, Molecular Weight Cut-Off) de 10kDa. posteriormente se centrifugó 12000rpm por 20min, la proteína recuperada se desnaturalizó (90°C) y se cargó (buffer de carga 1X) en un gel preparativo (SDS-PAGE 20x20cm), utilizando un marcador preteñido (Opti-Protein Marker, abm) para realizar el corte de la banda en el gel correspondiente al peso molecular esperado para la proteína recombinante (47.85kDa). Las bandas (inferior, media y superior) se cortaron, maceraron y eluyeron con agua MilliQ a 37°C en agitación constante durante 16 horas. La muestra, se centrifugó a 5000g por 10min, recuperando el sobrenadante. Los eluidos recuperados, se cuantificarón y el proceso se monitoreo por SDS-PAGE 12% y western blot revelado con BCIP y NBT [44]. 6.2.6 Purificación por cromatografía de afinidad a metales acoplados La fracción soluble que contiene la proteína recombinante LbNAPRT6xHis se incubó con la resina HisPur™ Ni-NTA Resin High Density, (1mL de resina por 8mL de fracción soluble), esta se equilibró con buffer de unión (50 mM Fosfato de potasio, pH 7.8, 400 mM NaCl, 100 mM KCl, 10% Glicerol, 0,5% TritonX-100) durante 1 hora a 4°C en agitación constante. La mezcla se empacó en la columna y se extrajeron las proteínas no unidas, posteriormente se aplicó el siguiente gradiente: 10mM, 20mM, 50mM, 75mM ,150mM, 200mM y 300mM de Imidazol en el buffer 50mM Fosfato de potasio, pH 7.8, (400mM NaCl, 100mM KCl, 10% Glicerol, 0,5% TritonX-100). Se recolectaron las fracciones y se evaluaron mediante SDS-PAGE 12% y western blot [45]. 6.2.7 Evaluación de la actividad enzimática mediante ensayo directo Se realizó una mezcla de reacción que contenía 25mM HEPES/KOH pH 7.4, 7.4mM MgCl2, 1.25mM ATP, 1.25mM NA y 1.25mM PRPP. La reacción se inició al adicionar 5µg de las muestras a evaluar [46]. Las reacciones enzimáticas se incubaron a 37°C durante 5min y se detuvo agregando 100µL de HCLO4 1.2 M frío, la mezcla se incubó 15 minutos en hielo, posteriormente se centrifugó a 12000g durante 3 min, se recuperó el sobrenadante y se tomaron 150µL de la reacción y se neutralizaron con 40µL de K2CO3, se incubó y centrifugó a las mismas condiciones. Finalmente se tomaron 150µL de esta reacción para analizar mediante RP-HPLC, usando una columna C18 de 25cm de largo x 4.6 mm de diámetro interno, con un tamaño de partícula de 5µm (Phenomenex) en el cromatógrafo Hitachi. Se realizó un gradiente de elución utilizando el buffer A (0.1mM fosfato de potasio, pH 6.0) y B (metanol): 7 min buffer A (100%), 3.5 min buffer B (20%), 5 min buffer B (25%), 6.5 min buffer B (25%), 6.6 min buffer A (100%) [46], [47]. Las separaciones se efectuaron a temperatura ambiente con un flujo de 1ml/min, inyectando 5µL de muestra. La longitud de onda empleada fue 254 nm [13], [48]. 6.2.8 Producción de anticuerpos IgYs aviares contra la proteína LbNAPRT6xHis A partir de la proteína purificada por cuerpos de inclusión, se produjo una herramienta inmunológica IgYs contra la proteína recombinante, en gallinas de la raza hy line Brown de 50 semanas de edad [49]. Usando entre 50-150 ng de antígeno (LbNAPRT6xHis) en una relación 1:1 de adyuvante completo en la primera inoculación e incompleto en los dos periodos posteriores [50]. Se recolectaron 1mL de sangría durante el periodo de inmunización (3) y huevos (30). La presencia de los anticuerpos en sangre contra el recombinante, se evaluaron contra 250ng de antígeno y 250ng de BSA usando western blot (α-LbNAPRT- IgY 1:5000, anti-Chicken fosfatasa alcalina 1:10000, revelado con BCIP y NBT). 6.2.9 Inmunodetección de la proteína LbNAPRT endógena Para la detección de la proteína LbNAPRT se emplearon promastigotes de L. braziliensis cepa MHOM/BR/75M2904, cultivados en medio Schneider el cual se suplementado con suero fetal bovino 10% (V/V) a una temperatura de 26°C, en flasks de 25cm2 (T25), sin agitación. Para reconocer la proteína LbNAPRT endógena, se utilizó extractos celulares de aproximadamente 7,05x108 promastigotes de L. braziliensis (MHOM/BR/75M2904), los cuales se obtuvieron por centrifugación a 6500 rpm (rotor Microliter 30x2 sealed 75003652 ThermoFisher, Heraeus Megafuge 16R 75004271 ThermoFisher) por 10min a 4°C, realizando 2 lavados con 10mL de PBS 1x pH 7.4. Este extracto se resuspendió en 500µL de buffer de lisis (PBS 0.1x, cóctel de inhibidores de proteasas (1:250), TritonX-100 0.1%). Se incubó durante 40min a 4°C en agitación constante. Posteriormente se centrifugó durante 20min a 12000rpm a 4°C, con el propósito de separar las fracciones. A la fracción soluble se le agregó buffer de carga 6x (1:5) para SDS- PAGE y a la insoluble 200µL de 1x y se desnaturalizarón a 90°C. La fracción de proteínas totales se obtuvo lisando cerca de 1x105 células/µL de parásitos con buffer 1x (celulares totales). Las muestras fueron analizadas mediante SDS-PAGE 12% y WB (anticuerpos primarios αLbNAPRT6xHis-IgY 1:1000 purificados, revelado con BCIP y NBT) [51].spa
dc.description.notes• Estudiar a fondo las modificaciones postraduccionales que se infiere en el alineamiento bioinformático (His240, Tyr21) de la proteína LbNAPRT ya sea por inmunoprecipitación de la enzima o por mutagénesis dirigida a este sitio. • Por otro lado, en torno a las propiedades cinéticas de la proteína LbNAPRT6xHis, se requerirá un estudio a profundidad de los parámetros enzimáticos de afinidad por los sustratos NA y PRPP, usando como control la proteína HsNAPRT. • Con respecto a la expresión de la proteína recombinante LbNAPRT6xHis en el sistema heterólogo de E. coli, se recomienda aumentar la solubilidad de la proteína como, por ejemplo, re clonando la secuencia codificante en un vector de expresión que genere un tag más expuesto que le brinde mayor solubilidad, con el fin de establecer mejores condiciones de purificación y facilitar el estudio de la funcionalidad de esta enzima
dc.description.researchareaMetabolismo energético de parásitos protozoariosspa
dc.description.sponsorshipDivisión de investigación de la universidad nacional de Colombia sede bobota código: 203010035591spa
dc.format.extent93 páginasspa
dc.format.mimetypeapplication/pdfspa
dc.identifier.instnameUniversidad Nacional de Colombiaspa
dc.identifier.reponameRepositorio Institucional Universidad Nacional de Colombiaspa
dc.identifier.repourlhttps://repositorio.unal.edu.co/spa
dc.identifier.urihttps://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/84081
dc.language.isospaspa
dc.publisherUniversidad Nacional de Colombiaspa
dc.publisher.branchUniversidad Nacional de Colombia - Sede Bogotáspa
dc.publisher.facultyFacultad de Cienciasspa
dc.publisher.placeBogotá,Colombiaspa
dc.publisher.programBogotá - Ciencias - Maestría en Ciencias - Bioquímicaspa
dc.relation.referencesOrganización Mundial de la Salud, Leishmaniasis en las Américas. 2020spa
dc.relation.referencesL. Monzote, “Current treatment of leishmaniasis: a review,” Open Antimicrob Agents J, vol. 1, no. August, pp. 9–19, 2009, doi: 10.2174/1876518100901010009.spa
dc.relation.referencesG. Milon, “Leishmania parasites: could we consider them as living organisms per se?,” Microbes Infect, vol. 10, no. 9, pp. 1077–1081, 2008, doi: 10.1016/j.micinf.2008.07.009.spa
dc.relation.referencesM. Cayla, Y. R. Nievas, K. R. Matthews, and J. C. Mottram, “Distinguishing functions of trypanosomatid protein kinases,” Trends Parasitol, vol. 38, no. 11, pp. 950–961, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.pt.2022.08.009.spa
dc.relation.referencesF. M. Alves et al., “Trypanosoma spp. Neobats: Insights about those poorly known trypanosomatids,” Int J Parasitol Parasites Wildl, vol. 16, no. September, pp. 145– 152, 2021, doi: 10.1016/j.ijppaw.2021.09.003.spa
dc.relation.referencesAshutosh, M. Garg, S. Sundar, R. Duncan, H. L. Nakhasi, and N. Goyal, “Downregulation of mitogen-activated protein kinase 1 of Leishmania donovani field isolates is associated with antimony resistance,” Antimicrob Agents Chemother, vol. 56, no. 1, pp. 518–525, 2012, doi: 10.1128/AAC.00736-11.spa
dc.relation.referencesA. Chedere, M. Mishra, O. Kulkarni, S. Sriraman, and N. Chandra, “Personalized quantitative models of NAD metabolism in hepatocellular carcinoma identify a subgroup with poor prognosis,” Front Oncol, vol. 12, no. September, pp. 1–15, 2022, doi: 10.3389/fonc.2022.954512.spa
dc.relation.referencesM. Blum et al., “The InterPro protein families and domains database: 20 years on,” Nucleic Acids Res, vol. 49, no. D1, pp. D344–D354, 2021, doi: 10.1093/nar/gkaa977.spa
dc.relation.referencesS. Kumar, G. Stecher, M. Li, C. Knyaz, and K. Tamura, “MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms,” Mol Biol Evol, vol. 35, no. 6, pp. 1547–1549, 2018, doi: 10.1093/molbev/msy096.spa
dc.relation.referencesJ. Jumper et al., “Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold,” Nature, vol. 596, no. 7873, pp. 583–589, 2021, doi: 10.1038/s41586-021-03819-2.spa
dc.relation.referencesC. Li, R. Zhang, J. Wang, L. M. Wilson, and Y. Yan, “Protein Engineering for Improving and Diversifying Natural Product Biosynthesis,” Trends Biotechnol, vol. 38, no. 7, pp. 729–744, 2020, doi: 10.1016/j.tibtech.2019.12.008.spa
dc.relation.referencesL. J. Ortiz Joya, “Caracterización de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT) mediante análisis estructural y de interacción proteína-proteína,” Repositorio Institucional Biblioteca Digital, vol. 1, pp. 1–101, 2018, [Online]. Available: https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/64043spa
dc.relation.referencesL. Galassi et al., “Characterization of human nicotinate phosphoribosyltransferase: Kinetic studies, structure prediction and functional analysis by site-directed mutagenesis,” Biochimie, vol. 94, no. 2, pp. 300–309, 2012, doi: 10.1016/j.biochi.2011.06.033.spa
dc.relation.referencesA. S. Marletta, A. Massarotti, G. Orsomando, G. Magni, M. Rizzi, and S. Garavaglia, “Crystal structure of human nicotinic acid phosphoribosyltransferase,” FEBS Open Bio, vol. 5, pp. 419–428, 2015, doi: 10.1016/j.fob.2015.05.002spa
dc.relation.referencesW. Hanna-rose, “Uridine monophosphate synthetase enables eukaryotic de novo NAD+ biosynthesis from quinolinic acid,” pp. 1–16, 2017, doi: 10.1074/jbc.C117.795344.spa
dc.relation.referencesM. Gasparrini, L. Sorci, and N. Raffaelli, “Enzymology of extracellular NAD metabolism,” Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 78, no. 7, pp. 3317–3331, 2021, doi: 10.1007/s00018-020-03742-1.spa
dc.relation.referencesA. Armandi et al., “The Predictive Role of Extracellular NAPRT for the Detection of Advanced Fibrosis in Biopsy-Proven Non-Alcoholic Fatty Liver Disease,” 2023.spa
dc.relation.referencesV. Audrito, V. G. Messana, and S. Deaglio, “NAMPT and NAPRT: Two Metabolic Enzymes With Key Roles in Inflammation,” Front Oncol, vol. 10, no. March, pp. 1– 17, 2020, doi: 10.3389/fonc.2020.00358.spa
dc.relation.referencesA. Managò et al., “Extracellular nicotinate phosphoribosyltransferase binds Toll like receptor 4 and mediates inflammation,” Nat Commun, vol. 10, no. 1, pp. 1–14, 2019, doi: 10.1038/s41467-019-12055-2.spa
dc.relation.referencesT. Soga et al., “Molecular identification of nicotinic acid receptor,” Biochem Biophys Res Commun, vol. 303, no. 1, pp. 364–369, 2003, doi: 10.1016/S0006- 291X(03)00342-5.spa
dc.relation.referencesE. di Luccio and D. K. Wilson, “Comprehensive X-ray structural studies of the quinolinate phosphoribosyl transferase (BNA6) from Saccharomyces cerevisiae,” Biochemistry, vol. 47, no. 13, pp. 4039–4050, 2008, doi: 10.1021/bi7020475.spa
dc.relation.referencesJ. S. Chappie, J. M. Cànaves, W. H. Gye, C. L. Rife, Q. Xu, and R. C. Stevens, “The structure of a eukaryotic nicotinic acid phosphoribosyltransferase reveals structural heterogeneity among Type II PRTases,” Structure, vol. 13, no. 9, pp. 1385–1396, 2005, doi: 10.1016/j.str.2005.05.016.spa
dc.relation.referencesD. H. Shin, N. Oganesyan, J. Jancarik, H. Yokota, R. Kim, and S. H. Kim, “Crystal structure of a nicotinate phosphoribosyltransferase from Thermoplasma acidophilum,” Journal of Biological Chemistry, vol. 280, no. 18, pp. 18326–18335, 2005, doi: 10.1074/jbc.M501622200.spa
dc.relation.referencesL. S. Hanna, S. L. Hess, and D. L. Sloan, “Kinetic analysis of nicotinate phosphoribosyltransferase from yeast using high pressure liquid chromatography.,” Journal of Biological Chemistry, vol. 258, no. 16, pp. 9745–9754, 1983, doi: 10.1016/s0021-9258(17)44561-3.spa
dc.relation.referencesB. HM, H. K, and N. H, “Announcing the worldwide Protein Data Bank,” Nat Struct Biol, vol. 10, no. 12, p. 980, 2003.spa
dc.relation.referencesL. E. Contreras Rodríguez, “Obtención y caracterización bioquímica y funcional de la enzima recombinante nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT),” p. 226, 2016, [Online]. Available: http://bdigital.unal.edu.co/54932/spa
dc.relation.referencesD. Santiago and M. H. Ramirez-Hernandez, “Estudio del transporte de nucleótidos en parásitos intracelulares : caracterización de un posible transportador de NAD + en Leishmania braziliensis,” pp. 1–110, 2019.spa
dc.relation.referencesM. Akhoundi et al., “A Historical Overview of the Classification, Evolution, and Dispersion of Leishmania Parasites and Sandflies,” PLoS Negl Trop Dis, vol. 10, no. 3, pp. 1–40, 2016, doi: 10.1371/journal.pntd.0004349.spa
dc.relation.referencesOMS/OPS | Organización Panamericana de la Salud, “Situación epidemiológica leishmaniasis cutánea y mucosa número 10,” 2021, [Online]. Available: https://iris.paho.org/handle/10665.2/55344%0Aspa
dc.relation.referencesN. R. Fons et al., “PPM1D mutations silence NAPRT gene expression and confer NAMPT inhibitor sensitivity in glioma,” Nat Commun, vol. 10, no. 1, pp. 1–10, 2019, doi: 10.1038/s41467-019-11732-6.spa
dc.relation.referencesE. C. Meng, E. F. Pettersen, G. S. Couch, C. C. Huang, and T. E. Ferrin, “Tools for integrated sequence-structure analysis with UCSF Chimera,” BMC Bioinformatics, vol. 7, pp. 1–10, 2006, doi: 10.1186/1471-2105-7-339.spa
dc.relation.referencesN. Cerqueira, “Avogadro,” Revista de Ciência Elementar, vol. 4, no. 2, 2016, doi: 10.24927/rce2016.017.spa
dc.relation.referencesM. F. Sanner, “A component-based software environment for visualizing large macromolecular assemblies,” Structure, vol. 13, no. 3, pp. 447–462, 2005, doi: 10.1016/j.str.2005.01.010.spa
dc.relation.referencesA. Allouche, “Software News and Updates Gabedit — A Graphical User Interface for Computational Chemistry Softwares,” J Comput Chem, vol. 32, pp. 174–182, 2012, doi: 10.1002/jcc.spa
dc.relation.referencesM. Martins, T. M. Dinamarco, and R. Goldbeck, “Recombinant chimeric enzymes for lignocellulosic biomass hydrolysis,” Enzyme Microb Technol, vol. 140, no. 80, p. 109647, 2020, doi: 10.1016/j.enzmictec.2020.109647.spa
dc.relation.referencesE. F. Pettersen et al., “UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis,” J Comput Chem, vol. 25, no. 13, pp. 1605–1612, 2004, doi: 10.1002/jcc.20084.spa
dc.relation.referencesC. Mary, F. Faraut, L. Lascombe, and H. Dumon, “Quantification of Leishmania infantum DNA by a real-time PCR assay with high sensitivity,” J Clin Microbiol, vol. 42, no. 11, pp. 5249–5255, 2004, doi: 10.1128/JCM.42.11.5249-5255.2004.spa
dc.relation.referencesD. W. R. Joseph Sambrook, “Molecular Cloning_ A Laboratory Manual ( PDFDrive ).pdf.” 1989.spa
dc.relation.referencesI. H. Segel, “Enzyme Kinetics : Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady State Enzyme Systems Horizons in Biochemistry and Biophysics ( Volume 1 ),” John Wiley & Sons, vol. 60, no. 1, pp. 220–221, 1975.spa
dc.relation.referencesPromega, “Assembly of Restriction Enzyme Digestion,” Technical Manual, pp. 1–8, 2011.spa
dc.relation.referencesT. D. N. A. Ligase and U. Weiss, “T4 DNA Ligase, #EL0011,” vol. 10, pp. 4–5, 1983.spa
dc.relation.referencesPROMEGA corporation, “pGEM(R)-T and pGEM(R)-T Easy Vector Systems Technical Manual TM042 - pgem-t and pgem-t easy vector systems protocol,” pGEM(R)-T and pGEM(R)-T Easy Vector Systems Technical Manual TM042 - pgemt and pgem-t easy vector systems protocol.pdf, 2010, [Online]. Available: https://www.promega.co.uk/~/media/files/resources/protocols/technical manuals/0/pgem-t and pgem-t easy vector systems protocol.pdfspa
dc.relation.referencesAndrés González, “Aspectos Metodológicos De La Expresión De Proteínas En E. Coli,” Revista de Educación Bioquímica, vol. 37, no. 1, pp. 14–27, 2018.spa
dc.relation.referencesS. M. Singh and A. K. Panda, “Solubihzation and refolding of bacterial inclusion body proteins,” J Biosci Bioeng, vol. 99, no. 4, pp. 303–310, 2005, doi: 10.1263/jbb.99.303.spa
dc.relation.referencesH. Block et al., “Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC). A Review,” Methods Enzymol, vol. 463, no. C, pp. 439–473, 2009, doi: 10.1016/S0076- 6879(09)63027-5.spa
dc.relation.referencesK. Yamada, N. Hara, T. Shibata, H. Osago, and M. Tsuchiya, “The simultaneous measurement of nicotinamide adenine dinucleotide and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry,” Anal Biochem, vol. 352, no. 2, pp. 282–285, 2006, doi: 10.1016/j.ab.2006.02.017.spa
dc.relation.referencesR. K. Gholson, I. Ueda, N. Ogasawara, and L. M. Henderson, “The Enzymatic Conversion of Quinolinate to Nicotinic Acid Mononucleotide in Mammalian Liver,” Journal of Biological Chemistry, vol. 239, no. 4, pp. 1208–1214, 1964, doi: 10.1016/s0021-9258(18)91413-4.spa
dc.relation.referencesM. Pescaglini, V. Micheli, H. A. Simmonds, M. Rocchigiani, and G. Pompucci, “Nicotinic acid phosphoribosyltransferase activity in human erythrocytes: Studies using a new HPLC method,” Clinica Chimica Acta, vol. 229, no. 1–2, pp. 15–25, 1994, doi: 10.1016/0009-8981(94)90225-9spa
dc.relation.referencesD. Pauly, P. A. Chacana, E. G. Calzado, B. Brembs, and R. Schade, “Igy technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation,” Journal of Visualized Experiments, vol. i, no. 51, pp. 2–7, 2011, doi: 10.3791/3084.spa
dc.relation.referencesH. F. Stills, “Adjuvants and antibody production: Dispelling the myths associated with Freund’s complete and other adjuvants,” ILAR J, vol. 46, no. 3, pp. 280–293, 2005, doi: 10.1093/ilar.46.3.280.spa
dc.relation.referencesS. E. Villamil-Silva, L. J. Ortiz-Joya, L. E. Contreras-Rodríguez, G. J. Díaz, and M. H. Ramírez-Hernández, “Identification of a cytoplas-mic tryparedoxin peroxidase from leishmania braziliensis,” Revista Colombiana de Quimica, vol. 50, no. 2, pp. 3– 14, 2021, doi: 10.15446/rev.colomb.quim.v50n2.91721.spa
dc.relation.referencesS. Nylén and H. Akuffo, “Tracing immunity to human leishmaniasis,” Future Microbiology, vol. 4, no. 2. pp. 241–254, 2009. doi: 10.2217/17460913.4.2.241.spa
dc.relation.referencesR. Badaró, S. G. Reed, and E. M. Carvalho, “Immunofluorescent antibody test in American visceral leishmaniasis: sensitivity and specificity of different morphological forms of two Leishmania species,” Am J Trop Med Hyg, vol. 32, no. 3, p. 480—484, May 1983, doi: 10.4269/ajtmh.1983.32.480.spa
dc.relation.referencesC. Zeiss, “Axio Observer Inverted microscope”.spa
dc.relation.references“ZEISS Axio Observer Su sistema de microscopio invertido para metalografía Su sistema de microscopio invertido para metalografía,” pp. 1–20.spa
dc.relation.referencesM. Hedglin, B. Pandey, and S. J. Benkovic, “Characterization of human translesiHedglin, M., Pandey, B., & Benkovic, S. J. (2016). Characterization of human translesion DNA synthesis across a UV-induced DNA lesion. ELife, 5(OCTOBER2016), 1–18. https://doi.org/10.7554/eLife.19788on DNA synthesis acro,” Elife, vol. 5, no. OCTOBER2016, pp. 1–18, 2016, doi: 10.7554/eLife.19788.spa
dc.relation.referencesA. Amici et al., “Synthesis and Degradation of Adenosine 5′-Tetraphosphate by Nicotinamide and Nicotinate Phosphoribosyltransferases,” Cell Chem Biol, vol. 24, no. 5, pp. 553-564.e4, 2017, doi: 10.1016/j.chembiol.2017.03.010.spa
dc.relation.referencesD. Schomburg, I. Schomburg, and A. Chang, Eds., “Nicotinate phosphoribosyltransferase BT - Class 2 · Transferases VI: EC 2.4.2.1–2.5.1.30,” Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2007, pp. 137–145. doi: 10.1007/978- 3-540-49753-0_11.spa
dc.relation.referencesM. Hebditch, M. A. Carballo-Amador, S. Charonis, R. Curtis, and J. Warwicker, “Protein-Sol: A web tool for predicting protein solubility from sequence,” Bioinformatics, vol. 33, no. 19, pp. 3098–3100, 2017, doi: 10.1093/bioinformatics/btx345.spa
dc.relation.referencesP. Full, “Preliminary Full wwPDB X-ray Structure Validation Report,” vol. 0, no. 2001, pp. 1–13, 2015.spa
dc.relation.referencesC. G. Granados-ramírez, “nicotinato mononucleótido adenililtransferasa de Leishmania braziliensis Optimization of the nicotinamide / nicotinate mononucleotide adenylyltransferase inhibition assay from Leishmania braziliensis Resumen Introducción,” vol. 45, no. 176, pp. 721–730, 2021.spa
dc.relation.referencesI. Palmer and P. T. Wingfield, “Preparation and extraction of insoluble (Inclusionbody) proteins from Escherichia coli,” Curr Protoc Protein Sci, vol. 1, no. SUPPL.70, pp. 1–25, 2012, doi: 10.1002/0471140864.ps0603s70.spa
dc.relation.referencesS. A. Mirhosseini, A. M. Latifi, H. M. Hosseini, R. Seidmoradi, H. Aghamollaei, and G. Farnoosh, “The efficient solubilization and refolding of recombinant organophosphorus hydrolyses inclusion bodies produced in escherichia coli,” Journal of Applied Biotechnology Reports, vol. 6, no. 1, pp. 20–25, 2019, doi: 10.29252/JABR.06.01.04.spa
dc.relation.referencesM. A. Machuca and A. Roujeinikova, “Method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain,” Journal of Visualized Experiments, vol. 2017, no. 130, pp. 1–9, 2017, doi: 10.3791/57092.spa
dc.relation.referencesA. Singh, V. Upadhyay, A. K. Upadhyay, S. M. Singh, and A. K. Panda, “Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process,” Microb Cell Fact, vol. 14, no. 1, pp. 1–10, 2015, doi: 10.1186/s12934-015-0222-8.spa
dc.relation.referencesL. E. Contreras, R. Neme, and M. H. Ramírez, “Identification and functional evaluation of Leishmania braziliensis Nicotinamide Mononucleotide Adenylyltransferase,” Protein Expr Purif, vol. 115, pp. 26–33, 2015, doi: 10.1016/j.pep.2015.08.022.spa
dc.relation.referencesH. Zhang et al., “Characterization of Mycobacterium tuberculosis nicotinamidase/ pyrazinamidase,” FEBS Journal, vol. 275, no. 4, pp. 753–762, 2008, doi: 10.1111/j.1742-4658.2007.06241.x.spa
dc.relation.references“SUPPORTING INFORMATION for Characterization of Nicotinamidases: SteadyState Kinetic Parameters, Class-wide Inhibition by Nicotinaldehydes and Catalytic Mechanism,” pp. 1–15.spa
dc.relation.referencesL. Berná et al., “Expanding an expanded genome: long-read sequencing of Trypanosoma cruzi,” Microb Genom, vol. 4, no. 5, 2018, doi: 10.1099/mgen.0.000177.spa
dc.relation.referencesM. P. O. Montini, E. V. Fernandes, A. C. N. dos S. Ferraro, M. A. Almeida, F. C. da Silva, and E. J. Venancio, “Effects of inoculation route and dose on production and avidity of IgY antibodies,” Food Agric Immunol, vol. 29, no. 1, pp. 306–315, 2018, doi: 10.1080/09540105.2017.1376036.spa
dc.relation.referencesP. A. Moreno-gonz, “PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS AVIARES (IgYs) A PARTIR DE CUERPOS DE INCLUSIÓN DE UNA PROTEÍNA RECOMBINANTE CENTRAL EN EL METABOLISMO DEL NAD+,” Revista Colombiana de Química, vol. 42, no. 2, pp. 12–20, 2013.spa
dc.relation.referencesA. Rath, M. Glibowicka, V. G. Nadeau, G. Chen, and C. M. Deber, “Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins,” Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 106, no. 6, pp. 1760–1765, 2009, doi: 10.1073/pnas.0813167106.spa
dc.relation.referencesM. K. Crow, N. Karasavvas, and A. H. Sarris, “Protein aggregation mediated by cysteine oxidation during the stacking phase of discontinuous buffer SDS-PAGE,” Biotechniques, vol. 30, no. 2, pp. 311–316, 2001, doi: 10.2144/01302st04.spa
dc.relation.referencesZ. Zhang, Enhancing membrane and secretory protein production yields in Escherichia coli. 2020. [Online]. Available: http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:su:diva-176362spa
dc.relation.referencesY. Shi et al., “Abnormal SDS-PAGE migration of cytosolic proteins can identify domains and mechanisms that control surfactant binding,” Protein Science, vol. 21, no. 8, pp. 1197–1209, 2012, doi: 10.1002/pro.2107.spa
dc.relation.referencesD. Ochoa et al., “The functional landscape of the human phosphoproteome,” Nat Biotechnol, vol. 38, no. 3, pp. 365–373, 2020, doi: 10.1038/s41587-019-0344-3.spa
dc.relation.referencesP. R. Mayer, N. Huang, C. M. Dewey, D. R. Dries, H. Zhang, and G. Yu, “Expression, localization, and biochemical characterization of nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase 2,” Journal of Biological Chemistry, vol. 285, no. 51, pp. 40387– 40396, 2010, doi: 10.1074/jbc.M110.178913.spa
dc.relation.referencesL. Liu, K. Wang, Z. M. Zhu, and J. H. Shao, “Associations between P53 Arg72Pro and development of digestive tract cancers: A meta-analysis,” Arch Med Res, vol. 42, no. 1, pp. 60–69, 2011, doi: 10.1016/j.arcmed.2011.01.008.spa
dc.relation.referencesJ. J. Almagro Armenteros, C. K. Sønderby, S. K. Sønderby, H. Nielsen, and O. Winther, “DeepLoc: prediction of protein subcellular localization using deep learning,” Bioinformatics, vol. 33, no. 21, pp. 3387–3395, 2017, doi: 10.1093/bioinformatics/btx431.spa
dc.relation.referencesN. Hara, K. Yamada, T. Shibata, H. Osago, T. Hashimoto, and M. Tsuchiya, “Elevation of cellular NAD levels by nicotinic acid and involvement of nicotinic acid phosphoribosyltransferase in human cells,” Journal of Biological Chemistry, vol. 282, no. 34, pp. 24574–24582, 2007, doi: 10.1074/jbc.M610357200.spa
dc.rights.accessrightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessspa
dc.rights.licenseReconocimiento 4.0 Internacionalspa
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/spa
dc.subject.ddcBioquímicaspa
dc.subject.lembEnzimas-análisisspa
dc.subject.lembEnzymatic analysiseng
dc.subject.lembReacciones químicasspa
dc.subject.lembChemical reactionseng
dc.subject.lembParacitosspa
dc.subject.lembParasiteseng
dc.subject.proposalNAD+spa
dc.subject.proposalNicotinato fosfo-ribosil transferasaspa
dc.subject.proposalLeishmania braziliensisspa
dc.subject.proposalLbNAPRTspa
dc.titleIdentificación de una enzima involucrada en el metabolismo del NAD+ en Leishmania braziliensis, la nicotinato fosfo-ribosil transferasa (LbNAPRT)spa
dc.title.translatedIdentification of an enzyme involved in the metabolism of NAD+ IN Leishmania braziliensis, nicotinate phospho-ribosyl transferase (LbNAPRTeng
dc.typeTrabajo de grado - Maestríaspa
dc.type.coarhttp://purl.org/coar/resource_type/c_bdccspa
dc.type.coarversionhttp://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aaspa
dc.type.contentTextspa
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dc.type.redcolhttp://purl.org/redcol/resource_type/TMspa
dc.type.versioninfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionspa
dcterms.audience.professionaldevelopmentInvestigadoresspa
oaire.accessrightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2spa
oaire.awardtitleImplementación y desarrollo de dos estrategias para la detección y el diagnostico molecular: IgY vs aptamerosspa
oaire.fundernameDivisión de investigación de la universidad nacional de Colombia sede bobota código: 203010035591spa

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