Maestría en Ciencias - Bioquímica
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Ítem Estudio de las Nicotinamida Mononucleótido Adenilil Transferasas (NMNATs) de parásitos protozoos: Determinación de su bifuncionalidad como chaperonas moleculares e implementación de una metodología para su detección(Universidad Nacional de Colombia, 2024) Gomez Osorio, Valentina; Ramírez Hernández, María Helena; Gomez Osorio, Valentina [0000-0002-0775-4361]; Libbiq UnCiertas proteínas poseen la capacidad de ejercer más de una función, propiedad conocida como moonlighting. Las proteínas que más presentan esta característica son enzimas que tienen como actividad canónica rutas del metabolismo energético basal. Para que las proteínas puedan desempeñar su función o funciones, es necesario que tengan una conformación nativa. Para lograr esta estructura dentro de la célula, es necesario que las proteínas sean asistidas por las chaperonas moleculares. Las Nicotinamida Mononucleótido Adenilil Transferasas (NMNATs), además de su rol como paso final en la síntesis del nucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+), les ha sido descrita una función moonlight como chaperonas moleculares en varios organismos. Dada la alta importancia de las NMNATs, estas representan un blanco farmacológico relevante para el diagnóstico y tratamiento contra parásitos protozoos como Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi, y Giardia lamblia, los cuales tienen una alta incidencia en salud pública en Colombia. Por esta razón, se planteó el estudio de las NMNATs de estos parásitos, con el fin de comprobar si cuentan con actividad chaperona, y la implementación de una herramienta de detección molecular en la forma de aptámeros (oligonucleótidos de ADN). Para lograr esto, se identificaron in silico regiones compartidas entre NMNATs chaperonas y las de los parásitos. De manera in vitro, se expresó y purificó la LbNMNAT desde Escherichia coli M15 transformadas con el plásmido pQE30lbnmnat y se evaluó la actividad chaperona mediante ensayos de agregación e inactivación. Además, se utilizó la metodología SELEX para seleccionar preliminarmente aptámeros afines a la 6xHisHsNMNAT3, una de las proteínas estudiadas en este trabajo (Texto tomado de la fuente).Ítem Determinación del impacto de IGF2 en la comunicación entre trofoblasto y las células dNK(Universidad Nacional de Colombia, 2024-01-30) Guevara Prieto, Valentina; Umaña Pérez, Yadi Adriana; Guevara Prieto, Valentina [0000118585]; Guevara Prieto, Valentina 0000-0003-1535-615X; Grupo de Investigación en HormonasEn el proceso de implantación blastocística debe existir una comunicación continua entre las células de trofoblasto, las células dNK y otras poblaciones inmunes. Esta comunicación se centra en ejercer control inmunológico para mantener la receptividad materna. El aumento en la concentración de factores como el IGF2 se ha asociado a un incremento en la invasividad de las células trofoblásticas, siendo relevante estudiar los mecanismos que modulan la comunicación entre las células de trofoblasto y las células dNK en presencia de IGF2. Para esto se planteó un modelo in vitro, en el que se diferenciaron células pNK hacia un fenotipo tolerogénico similar a las células dNK (i-dNK) para co-cultivarlas con células HTR-8/SVneo. Se recogieron los medios condicionados de i-dNK (MidNK) para evaluar su efecto en la proliferación, invasión y migración de las células de trofoblasto estimuladas con IGF2 y los de células de HTR-8/SVneo estimuladas con IGF2 (MHIGF) para determinar los cambios en la expresión de marcadores de diferenciación en las células i-dNK. El análisis de los medios MHIGF muestra un incremento en la expresión de citoquinas relacionadas con la tolerogenia. Este efecto es suprimido en los medios de los co-cultivos, sugiriendo que la comunicación intercelular puede estar activando el papel regulador de las células dNK. Este resultado concuerda con los cambios en expresión génica y en cambios fenotípicos, que muestran la capacidad de las células i-dNK de ejercer regulación sobre las células de trofoblasto en respuesta al estímulo con IGF2. (Texto tomado de la fuente).Ítem Efecto de péptidos quiméricos en la proliferación y apoptosis de líneas celulares de cáncer y su correlación con los niveles de expresión de la integrina αVβ6(Universidad Nacional de Colombia, 2023) Díaz Sana, Erika Vanessa; Urquiza Martínez, Mauricio; https://scienti.minciencias.gov.co/cvlac/visualizador/generarCurriculoCv.do?cod_rh=0000019953; Grupo de Investigación en HormonasLa invasión celular, migración y metástasis en algunos tipos de tumores es promovida por la desregulación en la señalización del factor nuclear κβ y la sobre expresión de la integrina αvβ6. La presencia de esta integrina se correlaciona con malignidad de las lesiones, por lo que se considera un biomarcador y blanco terapéutico en células tumorales. El factor nuclear κβ (NF- κβ) regula la transcripción de genes involucrados en la respuesta inmune y respuestas celulares como adhesión, diferenciación y apoptosis. La activación inapropiada o exacerbada del NF- κβ está involucrada en diversos tipos de patologías como enfermedades inflamatorias crónicas, autoinmunes, y el desarrollo y progresión del cáncer, específicamente en carcinomas de seno, pulmón, boca, estómago, endometrio, páncreas, y ovario. En esta tesis reportamos que los péptidos quiméricos P63 y P68, sintetizados con motivos de unión la integrina αvβ6 y un motivo que bloquea la señalización del NF- κβ mediada por la proteína BCL-3. (1) Son capaces de unirse en mayor proporción a células de cáncer de cérvix, seno, leucemia linfoide aguda, melanoma y pulmón (HeLa, MCF-7, CCRF-CEM, Skmel 23 y A549 respectivamente) en comparación con líneas celulares no tumorales como HEK 293, fibroblastos y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de un individuo sano. (2) También, modifican el potencial de membrana mitocondrial de manera dosis y tiempo dependiente y (3) promueven la expresión de marcadores de apoptosis en las células tumorales HeLa y MCF-7 pero no en células normales. Estos resultados, permiten conocer el funcionamiento de los péptidos a nivel biológico y molecular y arrojan información sobre su potencial para controlar procesos tumorales de una manera específica y bajo efecto citotóxico en células sanas. (Texto tomado de la fuente).Ítem Desarrollo de herramientas moleculares para la implementación del sistema CRISPR-Cas9 en Leishmania braziliensis(Universidad Nacional de Colombia, 2024) Gutiérrez León, Jesús Esteban; Contreras Rodríguez, Luis Ernesto; Téllez Meneses, Jair AlexanderLas Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR) junto con sus proteínas asociadas (Cas), constituyen un sistema de defensa adaptativo procariota para contrarrestar infecciones virales. El sistema se ha aprovechado como una herramienta de edición génica programable, posibilitando diversos estudios y aplicaciones biotecnológicas, incluyendo la edición génica de organismos patogénicos como Leishmania y Trypanosoma. En Leishmania, el sistema CRISPR-Cas9 ha permitido caracterizar diversos genes de virulencia, así como la obtención de parásitos atenuados con potencial vacunal. Sin embargo, su implementación aún no ha sido reportada para este parásito en Colombia. El presente trabajó abordó el desarrollo de herramientas relacionadas con la implementación del sistema CRISPR-Cas9 en L. braziliensis, una de las especies circulantes en nuestro país. Específicamente, se emprendió la producción de anticuerpos policlonales aviares (IgY) anti-SpCas9, utilizando como antígeno la proteína Cas9 recombinante de Streptococcus pyogenes (SpCas9-6xHis). Estos anticuerpos resultaron ser sensibles, específicos y útiles para inmunodetectar la proteína SpCas9 en promastigotes de L. braziliensis transfectados con el plásmido pTB007 Viannia, el cual codifica para esta proteína. Adicionalmente, se abordó la expresión y purificación de la enzima T7 RNA Polimerasa (6xHis-T7RNAP) desde Escherichia coli, resultando útil para sintetizar ARN guías (sgRNA) y preparar complejos ribonucleoproteicos (SpCas9-sgRNA) funcionales, capaces de efectuar cortes de ADN in vitro. Por último, se implementó el sistema CRISPR-Cas9 para realizar edición génica sobre la nicotinamida mononucleótido adenililtransferasa de L. braziliensis (LbNMNAT), que participa en la síntesis del NAD, insertando la secuencia CfPGKB5’-mCherry en el extremo 5’ del gen de interés en parásitos que expresan SpCas9 y T7RNAP. Los análisis funcionales del gen revelaron un aumento de sus niveles de expresión, mientras que los ensayos de susceptibilidad ante estrés oxidativo mostraron mayores valores IC50 en los parásitos editados en comparación con muestras control, lo que sugiere que la síntesis del NAD puede estar relacionada con fenotipos fármaco-resistentes. De esta manera, se obtuvieron herramientas que facilitan la implementación del sistema CRISPR-Cas9 en L. braziliensis, un patógeno de interés para la salud pública del país. Así mismo, se demostró la posibilidad de aprovechar sistemas avanzados de biología molecular para estudiar genes relacionados con la síntesis del NAD en el contexto de enfermedades tropicales desatendidas como la Leishmaniasis (Texto tomado de la fuente).Ítem Estudio del metabolismo del NADP+ en parásitos de alta incidencia en la salud pública: Explorando la NAD Quinasa de Trypanosoma cruzi(Universidad Nacional de Colombia, 2024) Caldas Ortega, Luisa María; Ramírez Hernández, María Helena; Libbiq UnLos parásitos protozoarios son organismos eucariotas unicelulares causantes de gran variedad de enfermedades que afectan a cientos de millones de personas alrededor del mundo, constituyendo un desafío para la salud pública. Los tratamientos empleados actualmente presentan limitaciones a nivel de eficacia, seguridad y costo. En ese sentido, es necesario identificar nuevos blancos terapéuticos en las vías metabólicas esenciales para la supervivencia de los parásitos. El dinucleótido de adenina y nicotinamida (NAD+/NADH) y su forma fosforilada (NADP+/NADPH) son moléculas esenciales para la viabilidad y proliferación celular. La NAD quinasa es la única enzima capaz de generar NADP de novo y ha sido descrita y caracterizada en varias especies de eucariotas, arqueas y bacterias. En este trabajo se estudió la NAD quinasa de protozoarios de relevancia en la salud pública, mediante la generación de la proteína recombinante NAD quinasa de Trypanosoma cruzi (6xHis-SUMO-tTcNADK). Esta proteína permitió realizar los primeros ensayos para determinar la actividad enzimática, así como el desarrollo de una herramienta inmunológica esencial para establecer la localización citoplasmática de la proteína mediante técnicas de inmunodetección en epimastigotes. También fue posible analizar computacionalmente al candidato TcNADK en términos de predicción de sitios de escisión proteolítica, modificaciones covalentes e interacción proteína-proteína. Finalmente, en un análisis in silico se identificaron 18 secuencias candidatas a NADK en otras 16 especies de parásitos protozoarios, secuencias que codificarían para proteínas en su mayoría hidrofílicas con pesos moleculares que oscilan entre 21kDa y 195kDa, y que presentan los dominios y plegamientos característicos de las NAD quinasas, así como características únicas que serían relevantes para establecer blancos farmacológicos y entender la diversidad estructural de estas proteínas centrales en el metabolismo celular (Texto tomado de la fuente).Ítem Estudio del perfil de metilación de ADN en pacientes con síndrome progeroide neonatal (síndrome de Wiedemann-Rautenstrauch)(Universidad Nacional de Colombia, 2024-07-10) Barrera-Torres, Herman Fredy; Arboleda Bustos, Gonzalo Humberto; Muerte CelularEl síndrome progeroide neonatal de Wiedemann-Rautenstrauch (SWR) se caracteriza por la manifestación de diversos signos de envejecimiento desde el nacimiento, con una esperanza de vida muy reducida, en promedio de 7 meses, lo que lo distingue de otros síndromes progeroides. La etiología del SWR se ha relacionado con mutaciones en el gen de la subunidad A de la ARN polimerasa III (POLR3A), crucial en la regulación de la expresión de ARN de transferencia (tARN), ARN ribosomal 5S (5SrARN), ARN nucleares pequeños (snARN) y otros, lo que resulta en una disminución de la funcionalidad del complejo ARN polimerasa III (POLR3) y alteraciones en la biogénesis ribosomal y la traducción de proteínas, entre otros procesos. La mutación puntual en el gen POLR3A tiene un impacto considerable en el perfil de metilación de ADN de regiones y genes específicos, ocasionando una expresión anómala de genes y cambios en las dinámicas moleculares. En el caso de una paciente de 6 años (POLR3A: c. 3G>T), se observa hipometilación anormal en regiones del cuerpo del gen, mientras que en una paciente de 25 años (POLR3A: c. 3772 3773 del), se observa una tendencia hacia la hipermetilación en las regiones promotoras y del cuerpo del gen. La metilación anormal de genes debido a la mutación de POLR3A incide principalmente en las proteínas de membrana plasmática, alterando procesos celulares cruciales como la transducción de señales y la transcripción de ADN codificante. Los genes significativamente metilados inducen procesos de senescencia celular. La alteración de la metilación normal en dinucleótidos CpG por el SWR provoca una aceleración o desaceleración en la determinación de la edad biológica mediante el uso de relojes epigenéticos, lo cual es característico de un síndrome progeroide. El estudio del SWR y sus implicaciones epigenéticas proporciona una oportunidad singular para comprender los procesos fisiopatológicos del envejecimiento humano. La identificación del gen y la vía metabólica asociada con este síndrome probablemente contribuirá a un nuevo conocimiento sobre la fisiopatología del envejecimiento humano, con potenciales implicaciones significativas en la investigación del envejecimiento en general. (Texto tomado de la fuente)Ítem Identificación de genes asociados a cambios neurocomportamentales por la infección con virus Zika en ratones BALB/c(Universidad Nacional de Colombia, 2024-01) Chivatá Avila, Jaime Alexander; Álvarez Diaz, Diego Alejandro; Lozano Moreno, José Manuel; Chivatá Avila, Jaime Alexander [0001692043]; Genómica de Microorganismos EmergentesEl virus Zika (ZIKV) es un arbovirus causante del “Síndrome de zika congénito”, asociado con diversos desórdenes del neurodesarrollo (NDDs) donde la microcefalia es una de las manifestaciones más severas. Existen NDDs más leves que pueden pasar desapercibidos en neonatos, como trastornos del espectro autista, retrasos en el desarrollo neuropsicomotor y del lenguaje que resultan en dificultades sociales y académicas. Los modelos murinos de infección por ZIKV reproducen defectos motores y cognitivos reportados en humanos los cuales pueden evaluarse mediante dispositivos comportamentales para su posterior contraste con perfiles de expresión genética, útiles en la caracterización de NDDs por ZIKV. Este estudio se enfocó en identificar genes asociados a cambios comportamentales por la infección con virus Zika en ratones BALB/c juveniles. Se inocularon por vía subcutánea con ZIKV (MH544701.2) ratones con dosis de 6.8x103 PFU al 1 día post-natal (DPN). La presencia del virus en cerebelo y corteza se verificó y cuantificó a los 10 y 30 días post-nfección (DPI) mediante RT-qPCR, los potenciales déficits neuroconductuales se evaluaron a los 30 DPI mediante las pruebas de laberinto en T, rotarod y campo abierto para posteriormente secuenciar y obtener listas genes diferencialmente expresados (DEG) así como categorías funcionales mediante análisis de enriquecimiento de conjunto de genes (GSEA). Se obtuvo un modelo de infección por ZIKV con capacidad de infectar para infectar cerebro, permitir la sobrevida más allá del 30 DPI y causar alteraciones comportamentales leves relacionadas con la actividad cognitiva, pero no con la motora o motivacional, asociada a una fuerte subregulación de genes relacionados con la sinapsis y con funciones estructurales en axones, dendritas y recubrimiento de mielina. En conjunto, estos datos proporcionan nueva información sobre los genes y las posibles vías moleculares que se ven alteradas en un proceso de infección leve y sugiere genes candidatos para futuras investigaciones. (Texto tomado de la fuente)Ítem Expresión y caracterización funcional de una ADN polimerasa I de Geobacillus stearothermophilus(Universidad Nacional de Colombia, 2024) Estupiñan Molina, Cristian David; de Brito Brandão, Pedro Filipe; Calderón Manrique, Dayana; https://scienti.minciencias.gov.co/cvlac/visualizador/generarCurriculoCv.do?cod_rh=0000051741; https://www.researchgate.net/profile/Cristian-Estupinan; Biotecnología Molecular (CorpoGen); Grupo de Estudios para la Remediación y Mitigación de Impactos Negativos al Ambiente (GERMINA)La ADN polimerasa de Geobacillus stearothermophilus (ADN Pol I Bst), es un miembro de la familia A de las polimerasas, que posee características desplazamiento de hebra que favorecen su aplicación en métodos de amplificación isotérmica. En el presente trabajo se describe la expresión y caracterización funcional de una ADN Pol I Bst, iniciando por la secuenciación del plásmido mediante tecnología Oxford Nanopore, para confirmar la secuencia codificante de la proteína, seguido de un análisis in sillico, con el propósito de determinar la estructura 3D y sitios activos de la proteína. Posteriormente, se realizó la expresión, extracción, purificación, determinación de la actividad catalítica y análisis de funcionalidad mediante Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) a 65 °C por 60 min, utilizando cómo sustrato ARN de SARS-CoV-2. Los resultados reflejan una secuencia codificante de 576 aminoácidos que pertenece al fragmento grande de ADN Pol I Bst, el cual tiene peso molecular de 61,8 kDa. Se obtuvo una concentración de 2mg/ml de proteína total, que posee una actividad enzimática de 606.4 U y una actividad especifica de 3.0×105 U/mg. Finalmente, se demuestra que la proteína es funcional al amplificar una secuencia perteneciente al Orf1a de ARN de SARS-CoV-2. Aquí se presenta una proteína funcional, con libertad de operación para su distribución y que es aplicable a sistemas de amplificación isotérmica para el diagnóstico de enfermedades de importancia clínica (Texto tomado de la fuente).Ítem Caracterización de vesículas extracelulares tipo exosomas con marcador VEGF en un modelo de cáncer de mama(Universidad Nacional de Colombia, 2024) Molina Bejarano, Jorge Luis; Umaña Pérez, Yadi Adriana; Grupo de Investigación en HormonasLos exosomas, un tipo de vesícula extracelular, emergen en condiciones fisiológicas y patológicas como en el cáncer de mama, desempeñando un papel clave en la comunicación intercelular dentro y fuera del microambiente tumoral. Para comprender su función es esencial realizar la caracterización física y molecular de su composición, así como establecer sus interacciones en contextos biológicos. En este trabajo, se obtuvieron exosomas provenientes del cultivo in vitro de la línea celular de cáncer de mama MCF7. En condiciones de normoxia, se evaluaron dos métodos comerciales, uno basado en cromatografía de exclusión por tamaño y otro en filtración dirigida. Los exosomas purificados se compararon con los obtenidos mediante el método tradicional de ultracentrifugación diferencial, y la cromatografía de exclusión por tamaño se seleccionó como el método con mayor rendimiento, economía y accesibilidad para la purificación de exosomas. Posteriormente, se obtuvieron exosomas de la misma línea celular en condiciones de hipoxia mimética inducida por cloruro de cobalto, observando una disminución tanto en la producción como en el tamaño de los exosomas comparados a la condición de normoxia, sumado a una mayor producción de VEGF, aunque no estuvo asociado directamente a los exosomas. Finalmente, se observó que los exosomas producidos en hipoxia mimética favorecen la migración en células MCF7 y promueven características específicas en la formación de tubos en la angiogénesis inducida sobre células HUVEC (Texto tomado de la fuente).Ítem Optimización del procedimiento pretrasplante de descongelación de unidades de sangre de cordón umbilical: prevención en muerte celular(Universidad Nacional de Colombia, 2024) Urrego Orrego, Karen Yurany; Perdomo Arciniegas, Ana María; Fontanilla Duque, Martha Raquel; Urrego Orrego, Karen Yurany [000000023762826X]; Grupo de Investigación en Medicina transfusional, tisular y celular (GYMTIC)La sangre de cordón umbilical (SCU) es una fuente de progenitores hematopoyéticos (PH) usados como terapia en diversas patologías, principalmente de tipo hematológico. En Colombia, el grupo de investigación en medicina transfusional, tisular y celular (GIMTTYC) del Instituto Distrital de Ciencia, Biotecnología e Innovación en Salud (IDCBIS), desarrolló un programa clínico de captación de donantes y de banqueo de células de SCU, así como servicios de búsqueda de compatibilidad, reserva y distribución de unidades, bajo estándares internacionales de terapia celular. Los procedimientos de congelación y descongelación de SCU se validan en cada banco con el fin de mantener viables las células que se usarán en el trasplante. La variación de las condiciones en estos procedimientos impacta la recuperación y viabilidad celular, que puede afectar la potencia terapéutica de los trasplantes. Con el fin de corroborar la funcionalidad de las células, antes y después de la descongelación de las unidades de SCU, se realizan pruebas de viabilidad celular por citometría de flujo y clonogenicidad. Por lo tanto, establecer las condiciones para mantener el número y la viabilidad celular después de la criopreservación, antes del trasplante es clave para garantizar la calidad de unidades en esta etapa. Para descongelar las unidades de SCU, estas se diluyen o lavan para disminuir el efecto citotóxico del crioprotector. Sin embargo, el GIMTTYC todavía requiere estandarizar el procedimiento de descongelación. En este trabajo se validó la implementación in situ de un protocolo pretrasplante de descongelación de unidades de SCU con la perspectiva de establecer herramientas que mejoren la recuperación y viabilidad celular pretrasplante. (Texto tomado de la fuente)Ítem Estudio bioquímico del potencial funcional de dos cepas de Ganoderma lucidum (Reishi) cultivadas en Colombia para su aplicación en la industria de alimentos(2023-08-01) Morera Bedoya, German Darío; Ardila Barrantes, Harold Duban; Chegwin Angarita, Carolina; MORERA BEDOYA, GERMÁN DARIO; MORERA BEDOYA, GERMÁN DARIO [0000-0003-0633-0476]; Estudio de Actividades Metabolicas Vegetales; Química de Hongos Macromicetos ColombianosEl hongo macromiceto Ganoderma lucidum, es una fuente de compuestos bioactivos con actividades biológicas científicamente comprobadas. A pesar de esto, hay pocos estudios enfocados a estudiar el potencial bioquímico de las cepas de este hongo comercializadas en nuestro país. Es por ello por lo que en esta investigación se presentan los resultados del estudio de la capacidad antioxidante y la actividad inhibitoria de AGEs in vitro, así como la presencia de lectinas con actividad aglutinante, de dos cepas de este hongo cultivadas en Colombia de manera tradicional a escala industrial (EUA y BEL). Para ello se realizaron extractos empleando solventes de diferente polaridad y se evaluaron por métodos espectrofotométricos, la capacidad antioxidante y la inhibición de la formación de productos avanzados de glicosilación AGEs. Este análisis se complementó con un estudio dirigido a las potenciales moléculas bioactivas, usando determinación de metabolitos por métodos espectrofotométricos, perfilado cromatográfico (HPLC-DAD y CG-MS) y análisis estadísticos multivariados (PLS-DA). Finalmente, se evaluó en un modelo in vitro la presencia de lectinas midiendo la aglutinación de eritrocitos a partir de extractos proteicos de las dos cepas en estudio. Se encontró que los extractos etanólicos y en diclorometano de las dos cepas, presentan actividad antioxidante e inhibitoria de AGE. Sin embargo, la cepa BEL presentó los mayores niveles de dichas actividades; el análisis cromatográfico y estadístico permitió encontrar qué, diferentes metabolitos del tipo triterpenos, están relacionados con el potencial antioxidante e inhibitorio de AGEs. Por otro lado, se encontró que en esta misma cepa se presenta importante actividad antiaglutinante; la purificación y caracterización de las lectinas presentes permitieron determinar que en la cepa BEL, se presentan lectinas con propiedades bioquímicas que le otorgan potencial para ser usadas en la industria de alimentos. El presente estudio contribuye al conocimiento de la composición bioquímica del hongo G. lucidum y confirma su actividad biológica in vitro en el micelio producido en Colombia. (Texto tomado de la fuente).Ítem Fortalecimiento de la red nacional de laboratorios que realizan detección de SARS CoV-2 por PCR a través del desarrollo de herramientas metrológicas para el aseguramiento de la calidad de los resultados de medición(Universidad Nacional de Colombia, 2022) Dávila González, Sergio; Soto Ospina, Carlos Yesid; Leguizamón Guerrero, John Emerson; Dávila González, Sergio Luis [0009000292702159]; Grupo de Investigación en Metrología Química y Bioanálisis (GIMQB); Bioquímica y Biología Molecular de las Microbacterias (BBMM)El virus SARS CoV-2 es el agente etiológico patógeno causante de la enfermedad COVID-19, la que tuvo un rápido surgimiento de nuevos casos alrededor del mundo ocasionando la declaración de pandemia por parte de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Hasta la fecha, se han reportado alrededor de 664.9 millones de casos de COVID-19 alrededor del mundo y 6.7 millones de muertes por esta enfermedad; En este sentido, la detección de nuevos casos es una de las herramientas más utilizadas para hacer seguimiento al avance de la pandemia. A pesar de la existencia de varias estrategias para la detección del virus causante de la enfermedad, en la actualidad por su alta sensibilidad y fácil implementación, el método de referencia es la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés). En Colombia se conformó la red nacional de laboratorios para la detección del virus SARS-CoV-2, coordinada por el Instituto Nacional de Salud (INS), como un mecanismo para ampliar la capacidad de detección de casos positivos a nivel nacional. Con el objetivo de fortalecer ésta red nacional de laboratorios, el INS, en convenio con el Instituto Nacional de Metrología (INM), y con el apoyo de la cooperación internacional, desarrollaron un conjunto de herramientas para apoyar las actividades de aseguramiento de la calidad de los resultados de medición que llevan a cabo cada uno de los laboratorios de esta red; en particular se desarrollaron dos materiales de referencia (MR) a nivel de ARN en solución. Estos fueron caracterizados por PCR en tiempo real y PCR digital, ambas con retrotranscripción (RT), los cuales demostraron ser lo suficientemente homogéneos y estables para ser empleados como Item de Ensayo de Aptitud (IEA), asi como Control Positivo en un Ensayo de Aptitud (EA) para la detección de SARS CoV-2 por técnicas basadas en PCR, y un taller de transferencia técnica, respectivamente. El desarrollo y ejecución de estas actividad permitió identificar posibles debilidades metrológicas de los laboratorios en la detección de secuencias de SARS-CoV-2 por RT-PCR y mejorará la calidad de las mediciones desde la perspectiva de la vigilancia de salud pública. (Texto tomado de la fuente)Ítem Aplicación del sistema phage display para la producción de anticuerpos monoclonales: Una aproximación al desarrollo de herramientas para la detección de proteínas(Universidad Nacional de Colombia, 2023-10-27) Riascos Orjuela, Laura Estefanía; Ramírez Hernández, María Helena; Laboratorio de Investigaciones Básica en Bioquímica - LIBBIQLa tecnología phage display se ha constituido como una alternativa para la producción de anticuerpos recombinantes monoclonales (rmAbs) de alta calidad. En este trabajo, empleando el modelo aviar, se realizó una primera aproximación a la producción local de herramientas de importancia para la investigación científica en Colombia como los rmAbs desde IgYs para la detección de proteínas clínicamente importantes. En este caso, se utilizaron como antígenos los dominios N-terminal (NTD) y el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína Spike (S) de SARS-CoV-2. Estos dominios se expresaron en el sistema heterólogo de E. coli y se purificaron a partir de cuerpos de inclusión. Las proteínas recombinantes obtenidas (6xHis-SUMO-NTD y 6xHis-SUMO-RBD) fueron inoculadas en gallinas Hy-Line Brown siguiendo un esquema de inmunización previamente estandarizado. Durante el proceso de inmunización, se recolectaron huevos y sangrías con el objetivo de evaluar los anticuerpos policlonales (pAbs) allí presentes. Esto, permitió establecer que los IgYs de los últimos sueros de cada animal permitieron la detección de hasta 15,6ng de 6xHis-SUMO-NTD y 7,8ng de 6xHis-SUMO-RBD respectivamente. Los ensayos de especificidad evidenciaron el reconocimiento cruzado de otras proteínas recombinantes que cuentan con las etiquetas 6xHis o 6xHis-SUMO, indicando que en el proceso de inmunización se generaron anticuerpos contra dichas etiquetas. Con base en esto, se estableció que los dominios NTD y RBD expresados pueden funcionar como proteínas transportadoras o carrier de las etiquetas que se desempeñarían como haptenos. Por otro lado, una vez se finalizó el esquema de inmunización, se sacrificaron los animales para obtener los bazos a fin de extraer ARN. Luego, se sintetizó ADN complementario (ADNc) desde el cuál se amplificaron las regiones encargadas de codificar las cadenas variables ligeras (VL) y pesadas (VH) de las IgYs. Estas regiones fueron clonadas en el fásmido pSEX81 que cuenta con la secuencia codificante de una proteína de cobertura (pIII) del bacteriófago M13 a la cual se acoplan VL y VH. De esta forma, se construyeron librerías de un tamaño de 6,25x106 cfu para NTD y de 3,75x106 cfu para RBD. Células E. coli TG1 fueron transformadas por electroporación con los constructos obtenidos (pSEX81-ScFv) para el antígeno 6xHis-SUMO-RBD e infectadas con el hiperfago M13K07ΔPIII. Finalmente, después de llevar a cabo las rondas de biopanning, se obtuvo la librería a partir de la cual se han aislado clones específicos que reconocen a 6xHis-SUMO-RBD que podrán ser caracterizados y empleados en la producción de los rmAbs. (Texto tomado de la fuente)Ítem Estudio Celular y Molecular del Gen POLR3A asociado al Síndrome Progeroide Neonatal (Síndrome de Wiedemann-Rautenstrauch)(Universidad Nacional de Colombia, 2023-06-26) Santos-Gil, Daniel; Arboleda, Gonzalo; Santos-Gil, Daniel F. [https://scienti.minciencias.gov.co/cvlac/visualizador/generarCurriculoCv.do?cod_rh=0001688007]; Santos-Gil, Daniel [0000-0002-1309-8081]; Muerte Celular; Grupo de Neurociencias-Universidad Nacional de ColombiaEl síndrome de Wiedemann-Rautenstracuh (WRS) ha sido caracterizado como una entidad progeroide neonatal o de envejecimiento prematuro. Este grupo de síndromes tienen en común cambios monogenéticos que contribuyen a la aparición de fenotipos de envejecimiento que se evidencian en distintas etapas del desarrollo del individuo e in vitro presentan senescencia celular prematura. El WRS presenta un patrón de herencia autosómica recesiva cuya etiología es poco conocida. Recientemente se han descrito mutaciones en el gen POLR3A que codifica la subunidad catalítica A de la RNA polimerasa III. Esta enzima sintetiza un grupo de RNAs pequeños no codificantes (snRNAs), entre ellos tRNAs, 5S rRNA y U6 snRNA, que son importantes para el correcto funcionamiento del nucleolo, el ensamblaje de ribosomas, la traducción de proteínas y el metabolismo celular. Se planteó como objetivo describir las características celulares y moleculares de los fibroblastos WRS y la relación con un modelo de pérdida de función. Métodos: Se cultivaron fibroblastos primarios de dos pacientes WRS con variantes monoalélicas: WRS1[POLR3A c.3772_3773delCT (p. Leu1258Glyfs*12)] y WRS2 [POLR3A c.3G>T (p. Met1Leu*)]; fibroblastos knockout (KO) [POLR3A -/-] y fibroblastos control [POLR3A +/+]. Se determinó la expresión global de RNA mediante RNAseq, identificando los genes diferencialmente expresados de cada conjunto de datos, los cuales fueron filtrados y analizados según los criterios de exclusión a nivel estadístico y biológico. Se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento funcional con las bases de datos Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Por RTqPCR, inmunofluorescencia y western blot, se analizaron los patrones de expresión de POLR3A, la expresión y localización de marcadores nucleolares y los niveles de marcadores de senescencia celular. Resultados: Se observó que hay un desbalance en la transcripción de los genes diana de la RNA Polimerasa III. Se encontraron perfiles de expresión diferenciales y se identificaron los genes diferencialmente expresados (DEGs) de cada conjunto de datos, siendo 204 en común entre el fenotipo WRS y 147 con la condición KO. El análisis de enriquecimiento funcional mostró sobrerrepresentadas múltiples categorías, entre ellas la vía PI3K-Akt, la interacción del receptor con la matriz extracelular, el metabolismo del retinol y la regulación de la respuesta inflamatoria. Se detectó una mayor área de inmunoreactividad de los componentes nucleolares en los fibroblastos WRS, mientras que el grupo KO muestra una reducción; a nivel transcripcional y traduccional, hay un desbalance de los distintos componentes estructurales, acompañado de la reducción de la síntesis de los precursores ribosomales. Por último, se encontró una regulación al alza de los marcadores de senescencia celular P53/P21, P16/RB y GLB1. Conclusión: Las células WRS experimentan un proceso de senescencia celular prematura asociado a las mutaciones de POLR3A que conducen a una alteración de su función transcripcional. Esto resulta en un aumento en el área nucleolar, un desequilibrio en la producción de los componentes nucleolares y una alteración en la biogénesis ribosomal. Además, el análisis de enriquecimiento funcional reveló que múltiples vías de señalización están comprometidas como la supervivencia celular, la interacción y organización de la matriz extracelular y regulación de la respuesta inflamatoria. Estos hallazgos contribuyen a mejorar nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes del WRS, que explican la alteración funcional de POLR3A y que dan lugar al fenotipo de envejecimiento prematuro y senescencia celular. También, amplían nuestra comprensión del panorama funcional del complejo RNA Polimerasa III en diversos componentes celulares, procesos biológicos y funciones moleculares. (Texto tomado de la fuente)Ítem Evaluación del perfil metabolómico y su relación con el espectro clínico de sujetos positivos para SARS-CoV-2 en una población bogotana(Universidad Nacional de Colombia, 2022-12-20) Gómez Muñoz, Laura Alejandra; Sandoval Hernández, Adrián Gabriel; Cala Molina, Monica Patricia; Gómez-Muñoz, L. A; Arboleda Granados Humberto; Santamaria Torres Mary Andrea; Gómez Muñoz Lilia Nataly; Muerte CelularIntroducción: Recientemente la enfermedad por el coronavirus SARS-CoV-2, denominada COVID-19, se convirtió en pandemia causando más de 6,38 millones de muertes en el mundo, y en Colombia más de 6,3 millones de casos con más de 142 mil fallecidos, con una tasa de letalidad del 2,5 %. La enfermedad se caracterizó por presentar una prognosis heterogénea con una baja predictibilidad y elevada mortalidad. Objetivo: Evaluar la relación entre el espectro clínico de la COVID 19 y los cambios en el metaboloma del plasma sanguíneo de sujetos positivos para SARS-CoV-2 en una población bogotana. Metodología: Se recolectaron 100 muestras de plasma sanguíneo en colaboración con la Clínica Colsanitas y Unisanitas, agrupados según sus características clínicas en grupos leve, moderado y severo, más un grupo control. El análisis metabolómico y lipidómico multiplataforma no dirigido se realizó por GC/MS y LC/MS en MetCore, de la Universidad de los Andes, los análisis estadísticos se realizaron usando MetaboAnalyst 5.0 y el paquete deducer del software R. Resultados y análisis: Se encontraron 148 metabolitos alterados entre los grupos experimentales, incluyendo carbohidratos como la ribosa, alosa y manitol, lípidos como las fosfocolinas, lisofosfocolinas, lisofosfatidilcolinas y aminoácidos como lisina, acido glutámico y aminobutanoico, asociados con falla multiorgánica y procesos inflamatorios. Conclusiones: Los metabolitos encontrados en este estudio correlacionan con los reportados para otras poblaciones como europeas y asiáticas. Se identificaron incrementados en casos severos el ácido glutámico, el ácido 2-hidroxi-3-metilbutírico, y disminuida la ribosa que podría considerarse factores pronósticos de estado crítico para COVID-19. (Texto tomado de la fuente)Ítem Estudio de decorina durante la gestación en el humano y en la rata(Universidad Nacional de Colombia, 2022-07-07) Cano Bermúdez, María Alejandra; Caminos Pinzón., Jorge Eduardo; Garcés Gutiérrez, María Fernanda; Endocrinología y Nutrición BásicaDecorina (DCN) es un proteoglicano con funciones sobre la regulación de factores de crecimiento. El objetivo fue determinar los niveles séricos de DCN en gestantes sanas (GN) y con preeclampsia (GP), y los niveles séricos y la expresión de DCN en rata. En humano se incluyeron; GN (n= 50) y GP (n= 20), mujeres tres meses posparto (PP) (n=22) y mujeres no gestantes (NG) (n= 20). En Rata (Rattus norvegicus) se realizó un estudio experimental, se conformaron grupos de 12, 16 y 21 días de gestación y un grupo virgen control. Se usó ELISA para cuantificar DCN en humano y rata, qPCR e inmunohistoquímica. Los resultados mostraron que los niveles séricos de DCN disminuyeron significativamente en GN y GP en comparación con NG (p < 0.001) y PP (p < 0.001). Durante el tercer trimestre, DCN fue significativamente más alto en GP que GN (p < 0.01). En rata DCN no presentó cambios significativos entre la gestación y el grupo virgen control (p > 0.05). La expresión de mRNA de Dcn en placenta fue superior en 12d que en 16d y 21d (p >0.001), y en placenta de 12d DCN se distribuyó en el estroma de las vellosidades coriónicas. En conclusión, los niveles séricos de DCN disminuyeron durante la gestación en mujer y en rata. DCN no represento utilidad diagnóstica en GP. DCN inhiben diferentes factores de crecimiento como factor de crecimiento transformante-beta (TGF-β), y su disminución durante la gestación puede estar relacionada con favorecer la angiogénesis. (Texto tomado de la fuente)Ítem Relevancia del receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1R) en el fenotipo celular pluripotente de trofoblasto humano(Universidad Nacional de Colombia, 2023) Ramírez Ambrosio, Oscar Mauricio; Umaña Pérez, Adriana; Grupo de Investigación en HormonasDiversos estudios han puesto de manifiesto la relación entre la señalización celular mediada por el receptor del Factor de Crecimiento similar a Insulina 1 (IGF-1R), la expresión de factores de pluripotencia canónicos, el cáncer y la enfermedad trofoblástica gestacional (ETG), sin embargo, se desconoce la relevancia de la señalización del IGF-1R mediada por IGF2, principal factor de crecimiento expresado durante la gestación, en la expresión de los factores de pluripotencia Oct4, Sox2 y Nanog en trofoblasto. Para acercarnos a este interrogante, se utilizó como modelo biológico la línea celular proveniente de trofoblasto humano del primer trimestre de gestación HTR-8/SVneo y una línea derivada de ella por silenciamiento estable para el IGF-1R (HTR-8/SVneo shIGF-IR). Ambas líneas celulares crecieron bajo privación de suero fetal bovino en presencia o ausencia de IGF2 10 nM durante 12, 24, 36, 48 y 72h. Los genes de interés se cuantificaron mediante RT-qPCR. HTR-8/SVneo presenta una sobreexpresión Masiva Aguda de los tres Factores de Pluripotencia (SEMA-FP) a las 12h respecto a la condición basal (Nanog: 43 veces, Oct4: 10 veces, Sox2: 8 veces, p<0.001) dependiente de niveles basales de IGF-1R, como respuesta a la privación de suero, probablemente como mecanismo de protección frente al estrés celular, manteniendo su potencial de diferenciación y de regeneración de sus subpoblaciones celulares. Oct4, Sox2 y Nanog presentan expresión mínima (basal) de transcrito independiente de la presencia de suero e IGF2, no obstante, el suero inhibe la SEMA-FP de los tres factores, mientras que IGF2, en ausencia de suero, inhibe parcialmente la de Oct4 y Nanog, pero no la de Sox2. Estas inhibiciones pueden depender o no de la existencia de niveles basales de IGF-1R para cada uno de los tres factores. La detección de los tres FP es retadora a nivel de proteína en HTR-8/SVneo debido a su baja expresión, la cual se limita a subpoblaciones celulares específicas. IGF-1R y Nanog se postulan como blancos moleculares a ser tenidos en cuenta en estudios dirigidos al tratamiento de ETG como coriocarcinoma, particularmente aquellos que poseen células madre del cáncer y presentan resistencia a tratamientos convencionales. (Texto tomado de la fuente)Ítem Efecto de péptidos derivados de la proteína gp85 del virus de Epstein-Barr sobre la expresión de citoquinas en células mononucleares de sangre periférica(Universidad Nacional de Colombia, 2023) Botero Buitrago, Jenny Alejandra; Urquiza Martínez, Mauricio; Botero Buitrago, Jenny [0000000199904648]; Grupo de Investigación en HormonasLas citoquinas son proteínas involucradas principalmente en la comunicación intercelular durante la respuesta inmune. Algunas citoquinas pueden inhibir el desarrollo y progresión de tumores, y estos efectos parecen estar relacionados con la modulación de la respuesta antitumoral. Estudios previos han identificado moléculas capaces de regular su expresión, entre ellas, un péptido derivado del sitio de unión de la glicoproteína gp85 del virus de Epstein-Barr a leucocitos humanos, denominado 11438. En este trabajo, se evaluó el efecto de este péptido y su análogo (33210) sobre la producción de citoquinas pro y antiinflamatorias, a nivel de ARNm y de proteína, en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) sanas, así como la inducción de cambios fenotípicos en esta población celular. Se determinó que los péptidos inducen un aumento en la expresión génica de citoquinas como IL-12B e IL-4, y que el péptido 33210 modificó el perfil de expresión de citoquinas a nivel de proteína al aumentar la producción de citoquinas inflamatorias como TNF-α, IL-8 e IL-6. Con relación a los marcadores de superficie de linfocitos y monocitos específicamente, se estableció una tendencia que indica que los péptidos modifican su expresión, indicando una regulación continua de la respuesta inmune. Estos resultados sugieren que los péptidos evaluados pueden actuar como moléculas promisorias para ayudar a la erradicación de células tumorales, en tanto inducen una activación de la respuesta inmune mediada por la expresión de citoquinas pro y antiinflamatorias. (Texto tomado de la fuente)Ítem Efecto de la aplicación de fosfito de potasio en la biosíntesis de metabolitos durante la interacción clavel (Dianthus caryophyllus L.) - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi(Universidad Nacional de Colombia, 2023-07-19) Barreto Pulido, Wanner Ernesto; Ardila Barrantes, Harold Duban; Coy Barrera, Ericsson David; Barreto Pulido, Wanner [0001686629]; Barreto Puldio, Wanner [0009-0004-1085-1041]; Estudio de Actividades Metabolicas VegetalesEn la presente investigación se estudió el efecto que tiene la aplicación de una disolución al 3% de fosfito de potasio en la bioquímica de raíces de clavel durante la inducción de resistencia al patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Si bien las disoluciones de fosfito de potasio han sido usadas como fertilizantes, fungicidas sistémicos o activadores de defensa natural, para el caso del cultivo del clavel, su uso ha sido limitado y existen solo algunos reportes recientes sobre su papel como inductor de resistencia. Es por ello que, con el fin de profundizar en los procesos involucrados en la acción de este inductor, en la presente investigación, aplicando herramientas de análisis metabolómico no dirigido, se estudiaron los metabolitos que se acumulan en raíces de la planta por acción de este inductor de resistencia y se estudió la expresión de genes asociados con algunos de los metabolitos de interés. Para ello, en una primera etapa se llevó a cabo un ensayo in vivo donde se seleccionó la estrategia para la aplicación de la disolución de fosfito en el suelo. Posteriormente, se realizó la obtención del perfil metabólico mediante GC-MS, con previa derivatización con agente sililante; en este punto se identificaron metabolitos diferenciables para los tratamientos estudiados, entre los cuales se destacan algunos aminoácidos, carbohidratos y ácidos orgánicos, entre otros. Estos resultados indicaron que mecanismos como el metabolismo de aminoácidos, transporte de nitrógeno, metabolismo de carbohidratos y señalización en plantas, son importantes en la inducción de resistencia. Finalmente, en una tercera etapa se estudiaron los niveles transcripcionales de los genes p5cr y npr1, los cuales participan en la biosíntesis de prolina y en la activación de RSA (Resistencia Sistémica Adquirida), respectivamente. Se encontró que la aplicación del inductor generó un aumento en los niveles transcripcionales de dichos genes en la variedad susceptible, confirmando a nivel molecular la activación de las rutas estudiadas en este fenómeno biológico. Los hallazgos encontrados en esta investigación permiten sugerir que el uso de fosfito de potasio, en su rol de inductor de resistencia, potencializa la síntesis de metabolitos asociados a defensa vegetal, muy probablemente asociada a la activación de RSA dependiente de ácido salicílico. (Texto tomado de la fuente)Ítem Estudio de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de leishmania braziliensis (LbNMNAT): Hacia la caracterización de un potencial blanco quimioterapéutico(Universidad Nacional de Colombia, 2023) Pérez Mancipe, William Alexander; Ramírez Hernández, María Helena; Pérez-Mancipe W; Laboratorio de Investigaciones Básicas en Bioquímica – LIBBIQLa leishmaniasis es un problema de salud pública en los países donde se presenta de manera endémica [1]. La búsqueda de fármacos de baja toxicidad para el paciente y la identificación de nuevos blancos terapéuticos, han sido unas de las estrategias de lucha en contra de esta parasitemia. El Laboratorio de investigaciones básicas en bioquímica (LIBBIQ), ha concentrado su interés en el metabolismo del Dinucleótido de Nicotinamida y Adenina (NAD+) en Leishmania braziliensis, específicamente en la enzima central de su metabolismo, la Nicotinamida Mononucleotido Adenilil Transferasa (LbNMNAT). Resaltando sus características como posible blanco terapéutico por su papel fundamental en el metabolismo del parásito y su supervivencia [2]. Por ello se consideró de relevancia continuar con la caracterización de la LbNMNAT, una enzima central en el metabolismo del NAD+. En este trabajo se emplearon diversas estrategias metodológicas bioinformáticas y experimentales. Inicialmente se emplearon promastigotes para evaluar el efecto que tendrían algunos derivados imidazolicos sobre su viabilidad, para ello se empleo el método colorimétrico (MTT), hallando efecto con el ketoconazol con un IC50 de 27,9 μM; también se planteó una propuesta metodología utilizando la Proteína verde fluorescente para evaluar estos efectos [3], [4]. Se generaron proteínas recombinantes para analizar el efecto de los derivados imidazolicos sobre la actividad catalítica de la LbNMNAT. Se encontró inhibición con los derivados benzimidazólicos (fenbendazol y el mebendazol) en concentraciones micromolares, lo cual podría estar relacionado con las bajas energías de unión que fueron predichas en el acoplamiento molecular para estos compuestos. Finalmente, en busca de caracterizar estructuralmente a la LbNMNAT, se analizó el efecto de la fosforilación como mecanismo de regulación enzimática; empleando análisis bioinformáticos, se predijo el residuo serina 210 como el sitio más probable de ser fosforilado. V Para el estudio de la fosforilación de la LbNMNAT se emplearon herramientas de biología molecular; mediante mutagénesis dirigida se generó el mutante fosfomimético LbNMNAT S210D, el cual corresponde a una región especifica de la proteina del parásito. El análisis del efecto de la mutación fosfomimética sobre la actividad adenilil transferasa de la enzima, evaluado por ensayos enzimáticos directos (RP-HPLC), no mostro diferencias respecto a la proteina nativa. Sin embargo, es necesario explorar el efecto que podría tener esta modificación sobre otras posibles funciones de la Lb-NMNAT, que se encuentran en investigación tales como la actividad chaperona. (Texto tomado de la fuente)