Validación funcional del gen de resistencia candidato de yuca a bacteriosis vascular rxam2 por ARN de interferencia
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Autores
Ochoa Cabezas, Juan Camilo
Director
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Español
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Resumen
La bacteriosis vascular es una de las enfermedades más importantes que atacan el
cultivo de yuca y es causada por la bacteria Xanthomonas axonopodis pv. manihotis
(Xam). RXam2 es un gen que codifica una proteína de tipo NBS-LRR que se encuentra
asociado a un QTL que explica el 62% de la resistencia a la cepa de Xam CIO151.
Previamente fragmentos de 618pb de este gen fueron clonados en el vector de
silenciamiento pHellsgate12, el cual es compatible con la tecnología Gateway®. Este
vector contiene insertos del gen a silenciar en sentido y antisentido separados por un
intrón, lo que producirá silenciamiento génico mediado por ARN de doble cadena. Esta
construcción fue transformada en A. tumefaciens y posteriormente en plantas de yuca de
la variedad 60444 con el fin de silenciar RXam2. En total se obtuvieron cinco plantas
transgénicas de las cuales se presenta la caracterización de dos de ellas, debido a que
presentaron anormalidades probablemente causadas por efectos pleiotrópicos del
silenciamiento. Las plantas transgénicas se distinguieron por tener crecimiento lento y
reducido, dificultad en la micropropagación, tallos más delgados y hojas más pequeñas.
Estas además presentaron una disminución en la expresión del gen que codifica para la
enzima fenilalanina amonio liasa, el cual es comúnmente expresado en las respuestas
de defensa. Aunque las plantas silenciadas no mostraron una susceptibilidad
estadísticamente significativa a la infección por el patógeno, si se observaron algunas
diferencias visuales en la intensidad y rapidez en la aparición de síntomas en las plantas
transgénicas silenciadas. Estos resultados sugieren que RXam2 es un gen involucrado
en la resistencia a Xam CIO151. Además de la cepa CIO151, se realizaron análisis
preliminares de evaluación de patotipos para determinar si las cepas actuales
corresponden a patotipos diferentes y poder estudiar en posteriores trabajos si RXam2
está involucrado en la resistencia a algunas de estas cepas (Texto tomado de la fuente).
Abstract
Cassava bacterial blight (CBB) is one of the most important diseases affecting cassava
(Manihot esculenta Crantz), and is caused by the gram-negative bacteria Xanthomonas
axonopodis pv. manihotis (Xam). RXam2 is a resistance gene candidate that codes for a
protein containing the NBS-LRR domains and it is associated to a QTL explaining 62% of
the resistance to Xam strain CIO151. We previously cloned fragments of 618bp from
RXam2 into pHellsgate12, an ihpRNA silencing vector that is compatible with gateway®
system. pHellsgate12 contains the sequences sense and antisense spliced by an intron
that will produce gene silencing mediated by double stranded RNA. This construction was
transformed in Agrobacterium tumefaciens and subsequently in cassava plants cultivar
60444 to silence RXam2. We obtained five transgenic plants but only two were described
here, probably caused by the abnormalities due to pleiotropic effects caused by silencing.
Transgenic plants showed slower growth, difficulties in in-vitro propagation, thinner
shoots and smaller leaves compared with control plants. Inoculated transgenic plants
showed a reduction in the expression of Phenylalanine ammonia-lyase gene that is
commonly expressed during cassava defense responses. Even though the transgenic
plants didn´t showed a statistically significant increased susceptibility, together these
results indicate that RXam2 is involved in resistance to Xam strain CIO151. We also
conducted pathotypic analysis of recent Xam strains to select new haplotypes of Xam that
can be used in subsequent works with silenced transgenic plants and test the effect of
RXam2 against new Xam strains.