Validación funcional del gen de resistencia candidato de yuca a bacteriosis vascular rxam2 por ARN de interferencia

Abstract

La bacteriosis vascular es una de las enfermedades más importantes que atacan el cultivo de yuca y es causada por la bacteria Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). RXam2 es un gen que codifica una proteína de tipo NBS-LRR que se encuentra asociado a un QTL que explica el 62% de la resistencia a la cepa de Xam CIO151. Previamente fragmentos de 618pb de este gen fueron clonados en el vector de silenciamiento pHellsgate12, el cual es compatible con la tecnología Gateway®. Este vector contiene insertos del gen a silenciar en sentido y antisentido separados por un intrón, lo que producirá silenciamiento génico mediado por ARN de doble cadena. Esta construcción fue transformada en A. tumefaciens y posteriormente en plantas de yuca de la variedad 60444 con el fin de silenciar RXam2. En total se obtuvieron cinco plantas transgénicas de las cuales se presenta la caracterización de dos de ellas, debido a que presentaron anormalidades probablemente causadas por efectos pleiotrópicos del silenciamiento. Las plantas transgénicas se distinguieron por tener crecimiento lento y reducido, dificultad en la micropropagación, tallos más delgados y hojas más pequeñas. Estas además presentaron una disminución en la expresión del gen que codifica para la enzima fenilalanina amonio liasa, el cual es comúnmente expresado en las respuestas de defensa. Aunque las plantas silenciadas no mostraron una susceptibilidad estadísticamente significativa a la infección por el patógeno, si se observaron algunas diferencias visuales en la intensidad y rapidez en la aparición de síntomas en las plantas transgénicas silenciadas. Estos resultados sugieren que RXam2 es un gen involucrado en la resistencia a Xam CIO151. Además de la cepa CIO151, se realizaron análisis preliminares de evaluación de patotipos para determinar si las cepas actuales corresponden a patotipos diferentes y poder estudiar en posteriores trabajos si RXam2 está involucrado en la resistencia a algunas de estas cepas (Texto tomado de la fuente).

Cassava bacterial blight (CBB) is one of the most important diseases affecting cassava (Manihot esculenta Crantz), and is caused by the gram-negative bacteria Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). RXam2 is a resistance gene candidate that codes for a protein containing the NBS-LRR domains and it is associated to a QTL explaining 62% of the resistance to Xam strain CIO151. We previously cloned fragments of 618bp from RXam2 into pHellsgate12, an ihpRNA silencing vector that is compatible with gateway® system. pHellsgate12 contains the sequences sense and antisense spliced by an intron that will produce gene silencing mediated by double stranded RNA. This construction was transformed in Agrobacterium tumefaciens and subsequently in cassava plants cultivar 60444 to silence RXam2. We obtained five transgenic plants but only two were described here, probably caused by the abnormalities due to pleiotropic effects caused by silencing. Transgenic plants showed slower growth, difficulties in in-vitro propagation, thinner shoots and smaller leaves compared with control plants. Inoculated transgenic plants showed a reduction in the expression of Phenylalanine ammonia-lyase gene that is commonly expressed during cassava defense responses. Even though the transgenic plants didn´t showed a statistically significant increased susceptibility, together these results indicate that RXam2 is involved in resistance to Xam strain CIO151. We also conducted pathotypic analysis of recent Xam strains to select new haplotypes of Xam that can be used in subsequent works with silenced transgenic plants and test the effect of RXam2 against new Xam strains.