Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en macrófagos humanos

Abstract

Porphyromonas gingivalis es un patógeno periodontal, que secreta vesículas de membrana externa (OMV) como vehículo de factores de virulencia e incluso se ha reportado que estas pueden ser más virulentas que la propia bacteria y podrían modular la respuesta inmune. Objetivo: Determinar las variaciones en la expresión de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos estimulados con vesículas de membrana externa de P. gingivalis. Métodos: Monocitos U937 fueron diferenciados a macrófagos y estimulados a diferentes tiempos con OMV, lisado bacteriano y bacteria viva. En experimentos independientes cada estímulo fue pre-tratado con los inhibidores KYT-1, KYT-36 y Polimixina-B para bloquear la acción de las gingipaínas R y K y además del LPS respectivamente. Se determinaron los niveles solubles de citocinas y quimiocinas y también del ARNm. Se usó ANOVA factorial para el análisis estadístico. Resultados: Las vesículas estimularon la producción de citocinas proinflamatorias y quimiocinas. Sin embargo, cuando se bloquean las gingipaínas R y K presentes en OMV, los niveles de IL-1β, IL-6, MCP-1, RANTES, MIP-1α e IL-8 aumentaron significativamente comparado con células sin estímulo y las estimuladas sin el bloqueo (p0,05). De manera contraria, se encontró una disminución en los niveles de TNF-α después de bloquear las proteasas o LPS. Conclusión: Las vesículas de membrana externa de P. gingivalis más que las bacterias vivas inducen cambios en la secreción de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos por eventos de proteólisis dependientes de gingipaínas lo cual podría estar involucrado en el establecimiento de un estado crónico característico de la enfermedad periodontal.

Abstract: Porphyromonas gingivalis is a periodontal pathogen, which secretes outer membrane vesicles (OMV) as a vehicle for virulence factors and it has even been reported that these can be more virulent than the bacterium itself and could modulate the immune respon se. Objective: To determine the variations in the expression of inflammatory mediators in human macrophages stimulated with outer membrane vesicles of P. gingivalis . Methods : U937 monocytes were differentiated into macrophages and stimulated at different t imes with OMV, bacterial lysate and live bacteria. In independent experiments each stimulus was pre - treated with inhibitors KYT - 1, KYT - 36 and Polymyxin - B to block the action of the R and K gingipains and in addition to the LPS respectively. The soluble lev els of cytokines and chemokines and also of the mRNA were determined. Factorial ANOVA was used for the statistical analysis. Results: The vesicles stimulated the production of proinflammatory cytokines and chemokines. However, when the R and K gingipains p resent in OMV are blocked, the levels of IL - 1β, IL - 6, MCP - 1, RANTES, MIP - 1α and IL - 8 increased significantly compared with cells without stimulus and those stimulated without the blockade (p 0.05). Conversely, a decrease in TNF - α levels was found after bl ocking proteases or LPS. Conclusion: The outer membrane vesicles of P. gingivalis , more than live bacteria , induce changes in the secretion of inflammatory mediators in human macrophages due to gingipain s - dependent proteolysis events , which could be involv ed in the establishment of a chronic state characteristic of periodontal disease.