Aproximación al estudio de la poli ADP ribosilación en protozoarios de interés en salud : identificación y caracterización de un candidato a poli (ADP-ribosa) polimerasa de Leishmania braziliensis

Abstract

Las poli ADP-ribosa polimerasas (PARPs) son miembros de una amplia familia de proteínas que catalizan la transferencia de motivos ADP-ribosa provenientes del NAD+ a diferentes moléculas blanco. En mamíferos se ha encontrado que los polímeros de ADP-ribosa están involucrados en diversos procesos celulares como la preservación de la integridad del genoma, transcripción génica, reparación del ADN, entre otras. Las PARP han sido poco estudiadas en organismos unicelulares de alta incidencia en la salud pública. A la fecha esta proteína ha sido identificada y caracterizada en algunos miembros de la familia Trypanosomatidae. Por otro lado, en parásito del género Leishmania se han presentado varios reportes que dejan en la ambigüedad la existencia de una PARP en estos parásitos. El principal propósito de esta investigación pretende realizar una incursión en la determinación de la existencia de una proteína tipo PARP en Leishmania braziliensis (LbPARP), una de las especies del género Leishmania que causa leishmaniasis en humanos. Para lo anterior, se partió de la amplificación de un candidato a LbPARP a partir de DNA genómico de promastigotes de Leishmania braziliensis, de donde fue posible clonar tres versiones del candidato en vectores de expresión en E.coli: pQE30-tLbPARP, pET26b(+)-Cter LbPARP y pET SUMO Nter LbPARP. La evaluación de las dos primeras versiones fue posible mediante estrategias in vitro (6xHis-tLbPARP) e in vivo (MTS-EGFP-Cter LbPARP) a través de su expresión en células de mamífero. La obtención del candidato recombinante permitió la generación de anticuerpos α-6xHis tLbPARP a partir de un modelo aviar, con esta herramienta fue posible determinar la localización intracelular del candidato en promastigotes. Adicionalmente, se hizo una exploración a través de herramientas bioinformáticas para la identificación de proteínas candidatas a varios factores del sistema de ADP-ribosilación en parásitos del género Leishmania. La identificación funcional de la proteína candidato a LbPARP se abordó combinando diferentes estrategia metodológicas y niveles celulares haciendo evidente la complejidad de los mecanismos de regulación que modulan la actividad de una proteína, los cuales deben ser considerados en estos estudios. Los resultados obtenidos representan un paso importante en la determinación de la existencia de una proteína tipo PARP en parásitos del género Leishmania. (Texto tomado de la fuente)

Poly ADP-ribose polymerases (PARPs) are members of a large family of proteins that catalyze the transfer of ADP-ribose motifs from NAD+ to different target molecules. In mammals, ADP-ribose polymers have been found to be involved in diverse cellular processes such as preservation of genome integrity, gene transcription, DNA repair, among others. PARPs have been studied little in unicellular organisms of high incidence in public health. To date, this protein has been identified and characterized in some members of the Trypanosomatidae family. On the other hand, in parasites of the genus Leishmania there have been several reports that leave the existence of a PARP in these parasites ambiguous. The main purpose of this research is to make an incursion into the determination of the existence of a PARP-like protein in Leishmania braziliensis (LbPARP), one of the species of the genus Leishmania that causes leishmaniasis in humans. For this purpose, a candidate LbPARP was amplified from genomic DNA of Leishmania braziliensis promastigotes, from which it was possible to clone three versions of the candidate in expression vectors in E.coli: pQE30-tLbPARP, pET26b(+)-Cter LbPARP and pET SUMO Nter LbPARP. The evaluation of the first two versions was possible by in vitro (6xHis-tLbPARP) and in vivo (MTS-EGFP-Cter LbPARP) strategies through their expression in mammalian cells. Obtaining the recombinant candidate allowed the generation of α-6xHis tLbPARP antibodies from an avian model, with this tool it was possible to determine the intracellular localization of the candidate in promastigotes. Additionally, an exploration was made through bioinformatics tools for the identification of candidate proteins for several factors of the ADP-ribosylation system in parasites of the genus Leishmania. The functional identification of the LbPARP candidate protein was approached combining different methodological strategies and cellular levels, making evident the complexity of the regulatory mechanisms that modulate the activity of a protein, which must be considered in these studies. The results obtained represent an important step in the determination of the existence of a PARP-like protein in parasites of the genus Leishmania.