Expresión y purificación de las proteínas recombinantes estructurales VP5, VP6 y VP8 del rotavirus / Expression and purification of recombinant structural rotavirus proteins VP5, VP6 and VP8

Abstract

La identificación de posibles receptores del rotavirus y su participación durante la unión y penetración del virus en células suceptibles a la infección han requerido la expresión y purificación de las proteínas virales. Por tanto, el objetivo general de este trabajo consistió en la expresión de las proteínas estructurales VP5 y VP8 del rotavirus en un sistema bacteriano y VP6 en células MA104 mediante la infección con el virus vaccinia recombinante. Las proteínas recombinantes fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad, en el caso de VP5 y VP8, las cuales presentaban una secuencia GST; mientras que VP6 fue purificada mediante el tratamiento con detergentes no iónicos debido a su alta insolubilidad. Las proteínas purificadas fueron utilizadas para la obtención de anticuerpos policlonales en conejos, demostrando su actividad antigénica. Adicionalmente, se logró identificar la interacción de las proteínas recombinantes VP5 y VP6 con las proteínas celulares recombinantes Hsc70 y PDI en dos sistemas libres de células. La interacción de las proteínas virales VP5 y VP6 con Hsc70 fue determinada en células MA104 y localizadas en microdominios lípidicos. Por otra parte, se demostró que la presencia de la proteína VP6 durante la unión y penetración del virus a las células, inhibió la infección viral casi en un 100%. Estos resultados sugieren la participación de las proteínas celulares Hsc70 y PDI durante los eventos iniciales del proceso infeccioso mediado por interacciones con las proteínas estructurales de la partícula viral. Cabe resaltar, que la proteína estructural VP6 puede estar implicada en las etapas iniciales de la infección y al parecer es un factor determinante en la entrada del virus a la célula. / Abstract. The identification of possible rotavirus receptors and their participation during the processes of rotavirus cell attachment and entry have required the expression and purification of rotavirus proteins. Accordingly, the general objective of this paper was to express the structural rotavirus proteins VP5 and VP8 in a bacterial system and VP6 was expressed in MA104 cell through the infection with recombinant vaccinia virus. The recombinant proteins were purified through affinity chromatography, by VP5 and VP8, because these proteins have a signal sequence of GST; while VP6 was purified with the treatment of the lysed cell with different non – ionic detergents, because this protein is very insoluble. The recombinant proteins were used for production of polyclonal antibodies in rabbits; this is evidence of this antigenic activity. Furthermore, these recombinant proteins were used for testing interaction with recombinant proteins of the cell, PDI and Hsc70. Theses assays showed that VP5 and VP6 interact with Hsc70 and PDI in a free cell system. The interaction between VP5/VP6 with Hsc70 was determined in MA104 cells and it was localized in lipids rafts. On the other hand, VP6 inhibited the infection of monolayers of MA104 near 100%. These results suggest that PDI and Hsc70 may be involved in the initial events of the rotavirus infection mediated by interactions with structural viral proteins. It should be noted, that VP6 might be involved in the processes of binding and entry of the viral particle into the cell and it is a key in the infection.