Caracterización de proteínas (NB) de Yuca (Manihot esculenta) implicadas en la interacción con el patógeno Xanthomonas phaseoli pv. manihotis (Xpm)
| dc.contributor.advisor | López Kleine, Liliana | spa |
| dc.contributor.advisor | López Carrascal, Camilo Ernesto | spa |
| dc.contributor.author | Bastidas Pardo, Margelly Andrea | spa |
| dc.contributor.researchgroup | Grupo de Investigación en Bioinformática y Biología de Sistemas | spa |
| dc.date.accessioned | 2025-04-03T13:39:42Z | |
| dc.date.available | 2025-04-03T13:39:42Z | |
| dc.date.issued | 2024 | |
| dc.description | ilustraciones, diagramas, tablas | spa |
| dc.description.abstract | La inmunidad de las plantas depende del reconocimiento efectivo de los patógenos, lo que se logra a través de receptores proteicos especializados. Entre estos, se encuentran las proteínas con un dominio NB-ARC (del inglés Nucleotide Binding - adaptor shared by APAF- 1 R proteins, and CED-4), que están involucradas en el reconocimiento directo o indirecto de las proteínas del patógeno conocidas como efectores. La expresión de los genes que codifican estas proteínas NB suele ser constitutiva y baja. La yuca, un cultivo clave en regiones tropicales del mundo, es vulnerable a enfermedades causadas por patógenos como Xanthomonas phaseoli pv. manihotis (Xpm) y mantiene interacciones con numerosos microorganismos presentes tanto en el suelo como en las hojas. Sin embargo, son pocos los estudios que han abordado el repertorio de estas proteínas en yuca. De igual manera no se ha profundizado sobre su expresión la cual puede ser modulada por factores tanto bióticos como abióticos. La presente investigación tiene como objetivo caracterizar a nivel de secuencia y expresión las proteínas que poseen el dominio NB-ARC de yuca implicadas en respuesta a diferentes estímulos bióticos y abióticos. El estudio se divide en tres fases, la primera es la de identificación de las proteínas de resistencia NB de la yuca mediante curación manual de las secuencias y la determinación del número de polimorfismos, utilizando bases de datos de secuencias y programas bioinformáticos. La segunda fase es la obtención del perfil de expresión de genes codificadores de proteínas NB en la yuca a partir de datos de expresión públicos (RNA-seq) obtenidos de la base de datos GEO del NCBI y el análisis diferencial de expresión (DEGs). Además, se construyeron redes de coexpresión para identificar interacciones entre los genes y se realizó un análisis filogenético mediante alineamientos de secuencias y la construcción de un árbol filogenético. Finalmente, la tercera fase incluye la integración de la información de expresión y polimorfismos y tiene como fin ahondar el conocimiento sobre procesos moleculares conocidos asociados a la interacción con Xpm, así como emitir nuevas hipótesis biológicas sobre esta interacción planta-patógeno a través de análisis descriptivos multivariados (Texto tomado de la fuente). | spa |
| dc.description.abstract | Plant immunity relies on the effective recognition of pathogens, achieved through specialized protein receptors. Among these, NB-ARC domain-containing proteins (Nucleotide Binding - adaptor shared by APAF-1, R proteins, and CED-4) are involved in the direct or indirect recognition of pathogen proteins known as effectors. The expression of genes encoding these NB proteins is typically constitutive and low. Cassava (Manihot esculenta), a key crop in tropical regions, is vulnerable to diseases caused by pathogens such as Xanthomonas phaseoli pv. manihotis (Xpm) and interacts with numerous microorganisms present in both soil and leaves. However, few studies have explored the repertoire of these proteins in cassava, and little is known about how their expression might be modulated by biotic and abiotic factors. This research aims to characterize cassava NB-ARC proteins at the sequence and expression levels in response to various biotic and abiotic stimuli. The study is divided into three phases, the first being the identification of cassava NB resistance proteins through manual sequence curation and polymorphism analysis using sequence databases and bioinformatics tools. The second phase focuses on obtaining the expression profiles of NB-encoding genes in cassava using public RNA-seq data from the GEO database (NCBI), applying differential expression (DEG) analysis. Additionally, co-expression networks were constructed to identify gene interactions, and a phylogenetic analysis was performed through sequence alignments and a phylogenetic tree construction. Finally, the third phase integrates expression and polymorphism data to deepen the understanding of molecular processes associated with interactions with Xpm, and, to generate new biological hypotheses about plant-pathogen interactions through multivariate descriptive analyses. | eng |
| dc.description.degreelevel | Maestría | spa |
| dc.description.degreename | Magíster en Ciencias - Microbiología | spa |
| dc.description.methods | La metodología para caracterizar las proteínas de resistencia NB en la yuca (Manihot esculenta) en diferentes condiciones, se desarrolló en tres fases principales. Este esquema ofrece una vista general de los pasos críticos que se siguieron, desde la identificación inicial de los genes NB, pasando por el análisis de sus perfiles de expresión, hasta la integración de los datos de polimorfismos y expresión génica. En la primera fase se realizó la identificación de las proteínas de resistencia NB de la yuca mediante curación manual de las secuencias y determinación de polimorfismos. En esta fase, se identificaron y se depuraron los genes NB, y se determinaron los polimorfismos asociados mediante secuenciación. En la segunda fase se determinó la obtención del perfil de expresión de genes codificadores de proteínas NB en la yuca a partir de datos de expresión públicos. Se realizó un análisis de expresión génica bajo diversas condiciones experimentales utilizando bases de datos públicas de RNA-seq. En la tercera fase se integró la información de expresión y polimorfismos, se organizaron los datos de expresión y polimorfismos en una tabla, culminando en la identificación de genes prioritarios a través del análisis de componentes principales (PCA). Cada fase representó un conjunto de procedimientos interrelacionados que fueron esenciales para profundizar en la comprensión del comportamiento de los genes NB en diferentes contextos biológicos. A continuación, se describen en detalle los pasos clave de cada una de estas fases. 1. Identificación de las proteínas de resistencia NB de la yuca mediante curación manual de las secuencias y determinación de polimorfismos. 1.1 Identificación y curación manual de los genes que codifican proteínas NB. La investigación se centró en el análisis de los genes de la yuca (M. esculenta) que codifican proteínas NB, utilizando la versión 8.1 de la anotación del genoma, disponible a través de la plataforma Phytozome. Dicha versión contiene aproximadamente 32.858 genes codificadores de proteínas. En primer lugar, se descargó la anotación de los genes de la yuca que pertenecen a la familia Pfam NBS (NB-ARC, PF00931) este proceso se realizó utilizando la herramienta BIOMART, disponible en la base de datos de Phytozome. Posteriormente, se llevó a cabo un proceso de confirmación de la anotación de los genes y para ello, se alinearon las secuencias utilizando el programa BLASTP (NCBI), con el fin de identificar aquellas secuencias que contenían el dominio NB-ARC, clave en la funcionalidad de las proteínas NB. Para asegurar la calidad de los resultados, se realizó una curación manual de las secuencias seleccionadas. Dicho proceso consistió en comparar las secuencias alineadas con la base de datos MOTIF (Searching Protein Sequence Motifs - GenomeNet), donde se verificó manual y visualmente la presencia del dominio NB-ARC. Aquellas secuencias que presentaban dominios incompletos o ausentes fueron eliminadas. Finalmente, las secuencias filtradas se alinearon utilizando el programa Clustal OMEGA, con el objetivo de identificar motivos conservados y variaciones en la estructura de las proteínas NB de la yuca. 1.2. Determinación de polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) La investigación se enfocó en la identificación de SNPs en muestras de variedades nativas de yuca mediante la técnica GBS, estas variedades fueron seleccionadas debido a su importancia local, adaptabilidad agroecológica y posible variabilidad genética asociada con resistencia a patógenos. Después de la secuenciación del genoma v8.1, se llevaron a cabo análisis de variantes para identificar los SNPs presentes en estas variedades. Posteriormente, con el objetivo de determinar la cantidad de SNPs asociados a los genes NBs, se implementó un enfoque programático. Se tuvo en cuenta la información de la posición y el número de cromosoma de los SNPs, se descargó la referencia de genes NBs de la herramienta Biomart de Phytozome y, mediante programación, se cuantificó el número de SNPs en cada gen NB, identificando su ubicación específica en el genoma. Este enfoque permitió un análisis preciso de la variabilidad genética en las variedades nativas de yuca, proporcionando información detallada sobre los SNPs asociados a los genes NBs en estas muestras. 2. Obtención del perfil de expresión de genes codificadores de proteínas NB en la yuca a partir de datos de expresión públicos 2.1. Perfil de expresión de genes codificadores de proteínas NB en la yuca a partir de datos de expresión públicos Se realizó un análisis de datos de expresión génica en M. esculenta (yuca) en respuesta a patógenos y estrés ambiental. Para la selección de los experimentos, se accedió a la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) del NCBI, donde se buscaron estudios relacionados con la yuca que abordaron su respuesta a condiciones de estrés, tanto biótico como abiótico. El enfoque se centró en experimentos que utilizaron técnicas de RNA-seq o expression profiling by high throughput sequencing, asegurando así la obtención de datos de alta calidad para el análisis de expresión génica. Se establecieron varios criterios para la selección de los experimentos: en primer lugar, se priorizó que los datos fueran accesibles y descargables para su posterior procesamiento. Asimismo, se tomó en cuenta que los estudios incluyeran un número considerable de muestras y réplicas, lo que garantiza la robustez estadística necesaria para el análisis. Finalmente, solo se consideraron aquellos experimentos que tuvieran relevancia biológica con el tema de estudio, es decir, la respuesta de la yuca a patógenos y estrés ambiental. Los datos fueron procesados en el entorno de R. Inicialmente, se descargaron los datos de expresión de cada experimento y se evaluó su calidad mediante la generación de un correlograma utilizando la función corrplot (Afzal et al., 2022). Esta visualización facilitó la identificación de datos atípicos y aseguró la consistencia del conjunto de datos antes de proceder con el análisis. Para optimizar aún más la calidad del conjunto de datos, se implementó un filtro que eliminó genes con baja o excesiva expresión. Se excluyeron los genes con sumas de expresión inferiores a 12 y superiores a 900,000, lo que permitió reducir el ruido en los análisis y centrarse en genes de mayor relevancia biológica. Finalmente, se llevó a cabo un análisis específico de los genes que codifican proteínas NB, que fueron identificados dentro del conjunto de datos filtrados. Los patrones de expresión de estos genes se evaluaron mediante la creación de mapas de calor utilizando la librería pheatmap del programa R, lo que permitió visualizar de manera clara las dinámicas de expresión y las posibles respuestas de los genes NB bajo las diferentes condiciones experimentales. Este enfoque fue fundamental para interpretar las respuestas de los genes NB a los estímulos patógenos y estrés ambiental. 2.2. Análisis diferencial de expresión génica Para el análisis de expresión génica de los experimentos seleccionados, se realizó un análisis diferencial de expresión génica (DEGs) con ayuda de la librería DESeq2 en el entorno de programación R, aplicando el mismo procedimiento a cada experimento de manera individual. Inicialmente, los datos fueron cargados y evaluados mediante un boxplot para identificar posibles outliers (valores atípicos) que pudieran alterar los resultados. La similitud entre las muestras fue evaluada utilizando el coeficiente de correlación de Pearson, con un umbral de 0.95 para asegurar una alta correlación entre las réplicas biológicas y garantizar la consistencia de los datos en cada experimento. Para mejorar la calidad de los datos en cada uno de los experimentos, se aplicó un filtro que eliminó genes con lecturas extremadamente altas (aproximadamente 100,000) y aquellos sin variabilidad significativa (varianza igual a 0). Este filtrado permitió centrarse en genes de mayor relevancia biológica, reduciendo el ruido en los análisis. Se construyó una tabla de condiciones experimentales (coldata) que incluía las variables tiempo y condición (control y tratamiento) y el diseño experimental fue modelado en DESeq2, lo que permitió evaluar cómo la expresión génica cambiaba en función del tiempo y las condiciones experimentales ya sea ante patógenos o estrés ambiental en cada experimento. El análisis se realizó utilizando la prueba de Likelihood Ratio Test (LRT), lo que permitió identificar genes con expresión diferencial significativa al comparar los modelos completos y reducidos. Para normalizar los datos, se utilizaron factores de tamaño estimados con estimateSizeFactors y se excluyeron muestras con factores de tamaño mayores a 3 o menores a 0.3 en cada experimento, asegurando la consistencia en la profundidad de secuenciación. Posteriormente, se aplicó la técnica de shrinkage con la función lfcShrink de la liberia apeglm, lo que permitió ajustar los coeficientes de expresión, particularmente en genes con baja expresión, reduciendo la varianza y mejorando la precisión de las estimaciones. Los coeficientes ajustados fueron visualizados mediante gráficos MA plot, destacando los genes más significativamente expresados en cada experimento. Se consideraron como significativamente expresados los genes con un valor p-adj inferior a 0.1, aplicando un umbral de False Discovery Rate (FDR) del 10%. Este valor de FDR fue calculado mediante la corrección de Benjamini-Hochberg, que controla la tasa y reduce la probabilidad de identificar positivos falsos. Para mejorar la visualización de los datos, se aplicó una transformación logarítmica regularizada (rlog) mediante la función rlog de DESeq2 en cada experimento. Esta transformación estabilizó la varianza y permitió una mejor representación de los genes de baja y alta expresión. Se generaron gráficos boxplot y corrplot con los datos transformados para confirmar la similitud entre las muestras. Luego se almacenaron los resultados de expresión diferencial de cada experimento en archivos CSV y se identificaron los genes que codifican para proteínas NB. Después se aplicó el mismo proceso de análisis diferencial exclusivamente al conjunto de genes (NBs) en cada experimento. 2.3. Red de coexpresión Para la construcción de la red de coexpresión, se utilizaron los datos que fueron previamente normalizados mediante la transformación logarítmica regularizada (rlog) de DESeq2 de cada uno de los experimentos, luego para cada conjunto de datos fue cargado y procesado para agrupar las réplicas biológicas y las condiciones experimentales, con el objetivo de calcular las medianas de expresión génica para cada grupo, después se realizó un proceso de filtrado para eliminar aquellas muestras que no eran de interés para el análisis, lo que permitió centrarse en las condiciones experimentales relevantes. Una vez seleccionadas las muestras, se llevó a cabo la normalización de los datos utilizando el método de normalización de varianza estable (VSN). Este método fue implementado para estabilizar la varianza a lo largo de las diferentes condiciones experimentales y asegurar que los valores de expresión fueran comparables entre las muestras, la efectividad de esta normalización fue evaluada mediante boxplots y gráficas de correlación para verificar la homogeneidad en la distribución de los datos después del proceso de normalización. Una vez obtenidos los datos normalizados, se procedió a construir la red de coexpresión, la cual se basó en el cálculo del coeficiente de correlación de Pearson entre las expresiones génicas. El coeficiente de correlación permitió medir la similitud entre los patrones de expresión y se utilizó un umbral (τ) de 0.88 para definir las conexiones entre los genes. Este umbral fue determinado mediante el análisis de la curva |Cr-Co|, que evalúa el balance entre el coeficiente de agrupamiento observado (Cr) y el esperado (Co). Los genes con correlaciones mayores o iguales a 0.88 fueron considerados como coexpresados y se incluyeron en la matriz de adyacencia que define la red. A continuación, se generó un gráfico a partir de la matriz de adyacencia, donde los nodos representan los genes y las aristas representan las conexiones basadas en la coexpresión. El análisis de la topología de la red se realizó utilizando varias métricas clave como; medidas de centralidad, donde se calculó el grado de nodo (degree) para cada gen, lo que representa el número de conexiones que tiene cada nodo en la red; hub- centralidad, esta métrica permitió identificar genes que actúan como centros importantes en la red, conectando un gran número de genes y facilitando la propagación de la información entre diferentes partes de la red. Se midió la betweenness de cada nodo, que indica cuántas veces un gen actúa como puente en los caminos más cortos entre otros genes, reflejando su importancia en la estructura de la red y la transitividad o también conocida como coeficiente de agrupamiento local, que sirve, para evaluar la tendencia de los genes a formar clústeres o grupos dentro de la red, lo que indica que tan interconectados están los vecinos de un nodo. Por último, la visualización y análisis detallado de la red de coexpresión se realizó utilizando la herramienta Cytoscape, que permitió representar gráficamente la red y realizar un análisis más profundo de su topología. La plataforma facilitó la identificación visual de los genes con mayor centralidad y la exploración de los módulos o clústeres dentro de la red. Se realizó la normalización de los datos utilizando el método Variance Stabilizing Transformation (VSN) y los análisis complementarios para evaluar la efectividad de la normalización. En cuanto a la construcción de la red de coexpresión se basó en el cálculo del coeficiente de correlación de Pearson, utilizando un umbral (τ) de 0.88 para definir las conexiones entre genes (Gaiteri et al., 2014). Se realizó un análisis detallado de la topología de la red, incluyendo medidas de centralidad, hub centrality, betweenness, degree, y transitivity. Los genes identificados se analizaron en términos de centralidad, utilizando herramientas como Cytoscape para visualizar la red y analizar su topología (Zhang & Horvath, 2005). 2.4. Análisis filogenético Se realizó el alineamiento de las secuencias utilizando el programa MAFFT en el servidor NGPhylogeny.fr, el cual fue empleado para garantizar la precisión en la alineación de las 197 secuencias. Posteriormente, se construyó el árbol filogenético mediante el método de máxima verosimilitud con el algoritmo PhyML, utilizando el modelo LG y la opción de bootstrap con 1000 repeticiones para evaluar la robustez de las ramas. La visualización del árbol filogenético fue generada mediante la herramienta de Newick Display en el mismo servidor, lo que permitió observar las relaciones evolutivas entre las secuencias y categorizar los genes en función de sus dominios conservados y similitudes estructurales. 3. Integración de la información de expresión y polimorfismos Para integrar de manera efectiva toda la información obtenida, se generó una tabla consolidada que incluyó los datos de los genes diferencialmente expresados (DEGs), la topología de la red de coexpresión, el número polimorfismos identificados (SNPs) y otras características relevantes de los genes. Posteriormente, se realizó un análisis de correlación general utilizando la herramienta corrplot en R, lo cual permitió evaluar de manera global las relaciones entre todas las variables medidas, el análisis mostró que los polimorfismos tienen una correlación más fuerte con las propiedades topológicas de la red que con los DEGs. Luego, se llevó a cabo una evaluación bivariada entre las diferentes características topológicas de la red (centralidad, grado, hubcentralidad y betweenness) y los polimorfismos. Este enfoque permitió identificar las conexiones más relevantes entre la estructura de la red y los polimorfismos, proporcionando una visión más detallada de cómo estos factores interactúan, además, este análisis permitió destacar los genes más significativos. Para reducir la dimensionalidad del conjunto de datos y resaltar las principales fuentes de variabilidad entre los genes analizados, se llevó a cabo un Análisis de Componentes Principales (PCA). Previamente, se generó un Scree Plot que ayudó a determinar el número óptimo de componentes y finalmente se realizó un Análisis de Componentes Principales (PCA) que permitió identificar los componentes principales que capturan la mayor parte de la variabilidad en los datos, proporcionando información clave sobre la distribución y agrupación de los genes en función de sus características (Conesa et al., 2016). A través de este análisis integrado, se destacaron genes clave que mostraron una combinación significativa de alta centralidad en la red de coexpresión y un número elevado de polimorfismos, destacando su relevancia en la funcionalidad biológica y su impacto potencial en las condiciones experimentales evaluadas (Wold et al., 1987). | spa |
| dc.description.researcharea | Estadística Genómica | spa |
| dc.format.extent | 106 páginas | spa |
| dc.format.mimetype | application/pdf | spa |
| dc.identifier.instname | Universidad Nacional de Colombia | spa |
| dc.identifier.reponame | Repositorio Institucional Universidad Nacional de Colombia | spa |
| dc.identifier.repourl | https://repositorio.unal.edu.co/ | spa |
| dc.identifier.uri | https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/87830 | |
| dc.language.iso | spa | spa |
| dc.publisher | Universidad Nacional de Colombia | spa |
| dc.publisher.branch | Universidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá | spa |
| dc.publisher.faculty | Facultad de Ciencias | spa |
| dc.publisher.place | Bogotá, Colombia | spa |
| dc.publisher.program | Bogotá - Ciencias - Maestría en Ciencias - Microbiología | spa |
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| dc.subject.proposal | Proteínas NB | spa |
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- Tesis de Maestría en Ciencias - Microbiología
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