Estudio de las condiciones de cultivo de las cepas PNV 310 (Diaporthe phaseolorum) y Streptomyces sp. IBUN 5.1 para la expresión de compuestos activos frente al fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides - Fase II

Abstract

El aguacate (Persea americana) es una especie frutal originaria de América, perteneciente a la familia Lauraceae. En Colombia, el 38 % del área sembrada corresponde a la variedad Hass (Persea americana Mill.), principal cultivar a nivel mundial gracias a sus destacadas características organolépticas y nutricionales, su producción constante y su fácil identificación del estado de madurez. Los frutos destinados a mercados internacionales requieren largos periodos de almacenamiento y transporte, durante los cuales suelen manifestarse los signos de enfermedades postcosecha. La enfermedad postcosecha de mayor prevalencia en el aguacate Hass es la antracnosis, causada por el fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides. El control biológico, mediante el uso de bioinsumos, se plantea como una alternativa sostenible y alineada con las demandas de los consumidores de productos libres de insumos sintéticos, ecológicos y de alta calidad. Con este contexto, este trabajo tuvo como objetivo identificar microorganismos antagonistas con potencial para ser empleados como biocontroladores del fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides, profundizar en el análisis de su actividad y contribuir al desarrollo de un agente microbiano para el manejo de la antracnosis del fruto causada por este fitopatógeno. Para ello, se inició evaluando la actividad antifúngica de microorganismos aislados de ambientes marinos y de un hongo proveniente del microbiota de cultivos sanos de aguacate, es decir, del cultivo de interés. Se empleo el método Analytic Hierarchy Process (AHP) como herramienta para la toma de decisiones, seleccionando las cepas Diaporthe phaseolorum PNV-310 y Streptomyces sp. IBUN 5.1 como las de mayor potencial. Con el objetivo de evaluar la inocuidad de Diaporthe phaseolorum PNV-310 y Streptomyces sp. IBUN 5.1, se realizaron ensayos de fitocompatibilidad en frutos de aguacate Hass y manzana verde. Además, se realizó el cultivo de estas cepas en diferentes medios de cultivo para identificar variaciones en la actividad antifúngica, evaluada mediante el método de microdilución en caldo. Las fracciones obtenidas fueron analizadas por espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida de alta resolución (LC-MS/MS), con el propósito de identificar posibles biomarcadores de actividad o virulencia y, así, establecer la viabilidad de su uso como biocontroladores. En el caso de Diaporthe phaseolorum PNV-310, la mayor actividad antifúngica se registró en las fracciones obtenidas del cultivo en el medio Avena 3. Sin embargo, en dichas fracciones se identificaron los compuestos Citocalasina H y Dicerandrol B, conocidos por su actividad citotóxica y clasificados como micotoxinas. Dado el riesgo potencial que representan para la inocuidad alimentaria, se considera indispensable realizar estudios toxicológicos adicionales antes de considerar el avance de esta cepa a fases posteriores de desarrollo como biocontrolador. Por su parte, la fracción con mayor actividad obtenida a partir del cultivo de Streptomyces sp. IBUN 5.1 fue la fracción butanólica del medio M3.7SAL, seguida de la obtenida en el medio GYM. El análisis por RMN no permitió identificar señales características de compuestos bioactivos debido a interferencias del blanco del medio de cultivo. No obstante, mediante LC-MS/MS se logró la identificación putativa de las 11 señales con mayor intensidad en los cromatogramas de iones totales (TIC). Estas señales corresponden a compuestos con actividad reportada como inhibidores enzimáticos, antimicrobianos y reguladores del crecimiento vegetal. Con base en estos resultados, y dada la ausencia de señales de toxicidad, pérdida de actividad antifúngica o virulencia, se decidió emplear esta cepa para el desarrollo de un agente microbiano. Para ello, se evaluó la compatibilidad de la cepa con diversos excipientes, con el objetivo de seleccionar aquellos más adecuados para su inclusión en un diseño experimental tipo Box-Behnken. Este diseño permitió definir la composición de un prototipo de polvo dispersable en agua a base del microorganismo Streptomyces sp. IBUN 5.1. Como resultado del análisis, se propuso una formulación compuesta por un 10,0 % de Trehalosa anhidra, 42,42 % del microorganismo Streptomyces sp. IBUN 5.1 y 0,77 % de Carboximetilcelulosa sódica de media viscosidad. Esta formulación fue posteriormente validada experimentalmente, lo que permitió confirmar la capacidad predictiva del modelo de regresión. Finalmente, se evaluó la actividad antifúngica del prototipo de polvo dispersable, obteniéndose un porcentaje de inhibición del fitopatógeno del 96.69 ± 0.22 %. (Texto tomado de la fuente).

The avocado (Persea americana) is a fruit species native to the Americas and belongs to the Lauraceae family. In Colombia, 38% of the cultivated area corresponds to the Hass variety (Persea americana Mill.), the leading cultivar worldwide due to its outstanding organoleptic and nutritional characteristics, consistent production, and ease of ripeness identification. Fruits intended for international markets require long storage and transportation periods, during which signs of postharvest diseases frequently appear. The most prevalent postharvest disease affecting Hass avocado is anthracnose, caused by the phytopathogen Colletotrichum gloeosporioides. Biological control using bio-inputs has been proposed as a sustainable alternative aligned with consumer demands for synthetic-free, ecological, and high-quality products. In this context, the aim of this study was to identify antagonistic microorganisms with potential use as biocontrol agents against Colletotrichum gloeosporioides, to further analyze their activity, and to contribute to the development of a microbial agent for the management of anthracnose in avocado fruit. To this end, the antifungal activity of microorganisms isolated from marine environments and of a fungus obtained from the microbiota of healthy avocado crops was assessed. The Analytic Hierarchy Process (AHP) method was employed as a decision-making tool, selecting Diaporthe phaseolorum PNV-310 and Streptomyces sp. IBUN 5.1 as the strains with the highest potential. To evaluate the safety of Diaporthe phaseolorum PNV-310 and Streptomyces sp. IBUN 5.1, phytocompatibility assays were conducted on Hass avocado and green apple fruits. In addition, the strains were cultured in different media to determine variations in antifungal activity, assessed using the broth microdilution method. The fractions obtained were analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), with the aim of identifying potential biomarkers of activity or virulence and thereby establishing their feasibility as biocontrol agents. For Diaporthe phaseolorum PNV-310, the highest antifungal activity was observed in fractions obtained from cultures in Oatmeal 3 medium. However, these fractions contained Cytochalasin H and Dicerandrol B, compounds known for their cytotoxic activity and classified as mycotoxins. Given the potential risk they pose to food safety, additional toxicological studies are deemed essential before considering the further development of this strain as a biocontrol agent. In the case of Streptomyces sp. IBUN 5.1, the fraction with the highest activity was the butanolic extract from the M3.7SAL medium, followed by that from the GYM medium. NMR analysis did not reveal characteristic signals of bioactive compounds due to interference from the medium blank. Nevertheless, LC-MS/MS allowed the putative identification of the 11 most intense signals in the total ion chromatograms (TIC). These signals corresponded to compounds with reported activity as enzyme inhibitors, antimicrobials, and plant growth regulators. Based on these results, and given the absence of toxicity signals, loss of antifungal activity, or virulence, this strain was selected for the development of a microbial agent. Compatibility with various excipients was evaluated to select the most suitable ones for inclusion in a Box–Behnken experimental design. This design enabled the formulation of a prototype water-dispersible powder based on Streptomyces sp. IBUN 5.1. As a result of the analysis, a formulation was proposed consisting of 10.0% anhydrous trehalose, 42.42% Streptomyces sp. IBUN 5.1, and 0.77% medium-viscosity carboxymethylcellulose. This formulation was subsequently validated experimentally, confirming the predictive capacity of the regression model. Finally, the antifungal activity of the prototype water-dispersible powder was evaluated, achieving an inhibition percentage of the phytopathogen of 96.69 ± 0.22%.