Búsqueda de compuestos con actividad antimicrobiana a partir de hongos aislados de ambientes marinos. Fase I.

Abstract

Colombia, un país con vocación agrícola, presenta problemas relacionados con el uso intensivo de agroquímicos para el control de fitopatógenos, los cuales han generado resistencia a los tratamientos convencionales. La tendencia actual en la producción agrícola es el uso de métodos ambientalmente amigables para el control de plagas y enfermedades, estos incluyen el uso de microorganismos como biocontroladores o como productores de compuestos de origen natural, ya que pueden ser menos tóxicos, presentar menor persistencia en el ambiente y mayor selectividad contra los patógenos. Durante las últimas décadas las investigaciones en productos naturales marinos han dirigido su mirada hacia los microorganismos, y dentro de estos hacia los hongos aislados de ambientes marinos, los cuales han mostrado ser una fuente rica en compuestos con diversas actividades biológicas y que permitiría un suministro sustentable de los compuestos, fracciones o extractos de interés. Entre las actividades biológicas que han mostrado los metabolitos producidos por estos hongos, la actividad antimicrobiana ha sido ampliamente estudiada. Así, con el ánimo de contribuir al estudio químico de los hongos que pueden cultivarse a partir de muestras recolectadas en el mar Caribe colombiano y evaluar su actividad como productores de compuestos antimicrobianos, con una perspectiva guiada hacia el control de fitopatógenos, se planteó este proyecto de maestría. En este estudio, se evaluaron un total de 15 aislamientos de hongos filamentosos obtenidos de ambientes marinos en el Caribe colombiano, los cuales se cultivaron por duplicado en dos medios líquidos durante tres semanas. Las fracciones obtenidas a partir del extracto en acetato de etilo de estos cultivos, fueron evaluadas contra las bacterias fitopatógenas Burkhorderia glumae ATCC 33617, B. gladioli ATCC 37041, and B. platarii ATCC 43733, patógenas del arroz. Encontrando que diez de los microorganismos evaluados son capaces de producir compuestos activos en alguno de los dos medios. Las cepas con mayor actividad fueron: Purpureocillium lilacinum PNM-67, Fusarium solani PNM-76 y Fusarium striatum PNM-AC10. Los ensayos de actividad antimicrobiana, perfiles de cromatografía líquida (HPLC-DAD-ELSD) y los reportes de cada especie, sirvieron como criterios para seleccionar a Purpureocillium lilacinum PNM-67 como la cepa más interesante para hacer estudios de derreplicación. Este estudio se inició por obtención de perfiles químicos por HPLC-MS/MS y la aplicación de técnicas de dos métodos de derreplicación química. Por un lado, derreplicando directamente listas de picos de ion molecular obtenidas a través de MZmine2 y por otro, haciendo uso de la construcción de redes moleculares (molecular networks) con espectros de MS/MS, una herramienta recientemente ofrecida por GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking). Los resultados de la derreplicación nos permitieron identificar al aislamiento PNM-67 Purpureocillium lilacinum como una cepa con diversidad metabólica y detectar en este, la presencia de compuestos peptídicos como la familia de las leucinostatinas, previamente reportadas en el género, junto con aeurobasidinas y la sansalvamida A. Finalmente, el estudio químico de los extractos en el medio PDB del hongo Purpureocillium lilacinum PNM-67 permitió la identificación de cuatro compuestos precursores de la leucinostatina A, para los cuales no se encontraron reportes en las bases de datos especializadas (Antimarin y Scifinder), los cuales se denominaron lilacininas A-D. Los compuestos 1 (lilacinina A) y 3 (lilacinina C) presentaron una actividad antimicrobiana moderada, siendo activos contra la bacteria B. gladioli a una concentración de 0.25 mg/mL. Este trabajo contribuyó a la búsqueda de nuevas fuentes de compuestos con actividad biológica aprovechable. Los resultados que aquí se muestran, evidencian el potencial de los hongos aislados de muestras marinas como productores de sustancias con actividad antimicrobiana contra bacterias fitopatógenas. Constituyéndose como un primer paso que sienta las bases para el desarrollo de procesos de base biotecnológica, que contribuyan al desarrollo sostenible de la industria agrícola del país.

Abstract. Agriculture represents an important part of the Colombian economy. One of the most common problems related with agricultural practices is the rising of resistant strains of phytopathogens as a consequence of the intensive use of agrochemicals. Currently, environmental friendly methods to control plagues and diseases are widely encouraged, and microorganisms represent a remarkable alternative among these methods. They can be used either as biocontrol agents or as a source of bioactive compounds. These compounds from natural sources are expected to be less toxic, more selective to control pathogens and less prevalent in the environment, indicating that they represent an advantageous alternative to treat diseases and plagues. In the last decades, marine natural products research has focused its attention on microorganisms and especially on marine-derived fungi. They constitute an outstanding source of bioactive compounds and also, they can be grown in laboratory conditions, a feature that constitutes a valuable approximation to solve the “supply problem” because they represent a sustainable source of compounds, fractions or extracts of interest. Within the bioactive compounds isolated from fungi the antimicrobial activity has been widely studied. Therefore, this work was designed with the aim to contribute with the study of fungi isolated from samples collected at the Colombian Caribbean by evaluating their capability to produce antimicrobial compounds. In this work, fifteen strains obtained from marine sources were cultivated by duplicate in two different culture media for three weeks. Later, the extracts obtained in ethyl acetate were fractionated and the biological activity of the obtained fractions was evaluated. Fractions were tested against the rice pathogens Burkhorderia glumae ATCC 33617, B. gladioli ATCC 37041 and B. platarii ATCC 43733. The most active strains were: Purpureocillium lilacinum PNM-67, Fusarium solani PNM-76 and Fusarium striatum PNMAC10. Antimicrobial assays, HPLC-DAD-ELSD chromatograms and strains previous reports, were used as criteria to select PNM-67 Purpureocillium lilacinum as the most interesting strain for its later chemical dereplication study The dereplication study started with the analysis of the samples by HPLC-MS/MS. The obtained results were analysed by two dereplication methodologies. The first methodology was based on a conventional approach where the molecular ion lists obtained through MZmine2 software were directly dereplicated. On the other hand, a mass networking strategy was considered. In this, MS/MS data are used to construct networks through the data-driven platform offered by the GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking). The obtained results allowed us to identify the strain Purpureocillium lilacinum PNM-67 as a metabolic diverse strain and detect some peptide type compounds such as: the leucinostatins family, previously reported to this genus; along with some aeurobasidins and the sansalvamide A. Finally, the ethyl acetate extract of Purpureocillium lilacinum PNM-67 grown in PDB media was studied. This allowed the identification of four precursors leucinostatin A, whose structures were not found in databases (Antimarin and Scifinder), and were named as lilacinins A-D. Compounds 1 (lilacinin A) and 3 (lilacinin C) exhibited mild activity against B. gladioli at a concentration of 0.25 mg/mL. This work contributed to the search of new sources of compounds with promising biological activity. The results suggest that fungi from marine environments are a potential source of compounds with antimicrobial activity against phytopathogen bacterias. Our findings constitute the first stage in a biotechnological process, that may contribute to the sustainable development of the agricultural industry in our country.