Evaluación de la actividad resortiva de cmnsp fusionadas con polietilenglicol (peg), tratadas con fuerza centrífuga y con n acetilcisteina (NAC)

Abstract

Con el objeto de evaluar la actividad resortiva de las células mononucleares de sangre periférica (CMNSP), estas fueron aisladas mediante un gradiente de ficol-Hipaque y estimuladas con 10 μg/ml de fitohemaglutinina (PHA) durante 72 h en medio de cultivo RPMI 1640 y suero fetal bovino al 10%. Aproximadamente 20.000 células fueron fusionadas con PEG 3000, otro grupo aproximadamente del mismo tamaño fueron sometidas a fuerza centrífuga a 60 RPM durante120 h, sembradas sobre láminas de hueso cortical bovino estériles de aproximadamente 5 x 5 mm2 x 0.5 de alto y tratadas o no con N-acetilcisteína (NAC). Para esto, se dividieron en 6 grupos de la siguiente manera: 1. Células no fusionadas. 2. Células no fusionadas + NAC. 3. Células no fusionadas + fuerza centrífuga. 4. Células no fusionadas + fuerza centrífuga + NAC. 5. Células fusionadas con PEG. 6. Células fusionadas con PEG + NAC. Transcurrido el tiempo de cultivo las células se fijaron con metanol ácido acético en proporción 1:3; se procedió a identificar proteínas de membrana utilizadas como marcadores característicos de osteoclastos. Entre estas proteínas están: ADAM-12, ATPasa, Integrina β3, DC-stamp, Receptor de calcitonina y Catepsina K. Igualmente se evaluó la actividad de la enzima tartrato resistente (TRAP). Posteriormente las células se retiraron de la lámina ósea y se evaluó la actividad resortiva sobre el hueso donde se cultivaron las células. Se encontró que al fusionar células con PEG, o aplicar fuerza centrífuga a células no fusionadas, se inducen marcadores característicos de células osteoclasticas y actividad resortiva, probablemente relacionado con un aumento de ROS, dado que al aplicar NAC los marcadores y la actividad resortiva disminuyen.

Abstract. Whit objective In order to assess the resorptive activity of mononuclear cells from peripheral blood (PBMC), these were isolated by a gradient of ficoll-Hypaque and stimulated with 10 ug / ml phytohemagglutinin (PHA) for 72 h in RPMI 1640 fetal bovine serum and 10%. Approximately 20,000 cells were fused with PEG 3000, another group of about the same size were subjected to centrifugal force for 60 RPM durante120 h, planted on sheets of cortical bovine bone sterile approximately 5 x 5 mm x 0.5 tall and treated or not with N -acetilcystein (NAC). For this, they were divided into 6 groups as follows: 1. Cells unfused. 2. unfused + NAC. 3. unfused + centrifugal force. 4. unfused + centrifugal force+ NAC. 5. cells fused with PEG. 6. cells fused with PEG + NAC. After the culture time the cells were fixed with acetic acid methanol in proportion 1: 3; we proceeded to identify membrane proteins used as markers characteristic of osteoclasts. Among these proteins are: ADAM-12, ATPase, β3 integrin, DC-stamp, cathepsin K, calcitonin recptor and activity enzyme tartrate resistant (TRAP) was evaluated. The cells were removed from the plate, and resorptive activity was evaluated on bone where the cells were grown. It was found that by fusing cells with PEG, or applying centrifugal force to unfused cells, markers characteristic of osteoclastic cells are induced and resorptive activity, probably related to an increase in ROS, since applying NAC markers and resorptive activity decrease.