Búsqueda y expresión de enzimas Lipolíticas sintetizadas por bacterias Epífitas de Ulva Lactuca presentes en el litoral rocoso “La Punta de la Loma” (Santa Marta – Colombia)

Abstract

Teniendo en cuenta el reciente interés por identificar y expresar enzimas de origen marino, el objetivo de este estudio fue identificar y expresar enzimas lipolíticas en el ADN metagenómico de las bacterias epífitas de la macroalga Ulva lactuca. Para ello se realizaron actividades de extracción de ADN total bacteriano de la superficie de los talos de la macroalga e identificación de posibles genes lipolíticos a través de PCR con primers específicos y degenerados. También se llevó a cabo la sub-clonación y expresión de genes previamente identificados en una librería metagenómica construida con ADN total bacteriano de U. lactuca, y la secuenciación de los potenciales genes lipolíticos. Como resultado, se obtuvo una cantidad aceptable de ADN total de alto peso molecular y de muy buena calidad. Este ADN total sirvió como molde para identificar un fragmento correspondiente a una Tiolasa marina, una enzima estrechamente relacionada con la función lipolítica; y un fragmento que podría representar una lipasa verdadera en el metagenoma de las bacterias epífitas de U. lactuca. Adicionalmente, se verificó la actividad de dos clones positivos para la actividad lipolítica obtenidos de una librería metagenómica previa. Así, a través de sub-clonación se obtuvieron 54 sub-clones activos y se confirmó la actividad de 15 de ellos al degradar los sustratos Tween 20 y tributirina. La presencia de los insertos responsables de la actividad lipolítica de los subclones más activos, fue verificada vía PCR. En cuanto al componente cultivable, se obtuvieron tres cepas de la superficie de U. lactuca con muy buena actividad lipolítica, en donde la cepa C11 identificado como Vibrio alginolyticus, resultó ser la más activa. Los resultados del presente estudio permiten entender la diversidad genética que existe en los ambientes marinos, principalmente en macroalgas verdes. Así, este sería el primer reporte de enzimas lipolíticas sintetizadas por bacterias epífitas de Ulva lactuca en el Caribe colombiano.

Abstract. According to the recent interest in identifying and expressing enzymes of marine origin, the aim of this study was to identify and express lipolytic enzymes in the metagenomic DNA of the epiphytic bacteria of the seaweed Ulva lactuca. To achieve this, total bacterial DNA was isolated from the surface of the seaweed stems. Then, identification of possible lipolytic genes through PCR with specific and degenerate primers was possible. Besides, sub-clonation and expression of genes previously identified in a metagenomic library constructed with total bacterial DNA from U. lactuca were also performed and finally the sequencing of potential lipolytic genes. As a result, an acceptable amount of high quality/molecular weight total DNA was obtained. This DNA served as template to identify a fragment corresponding to a Thiolase, also close-related to lipolytic enzymes, and another fragment that could represent a true lipase. Additionally, the activity of two lipolytic positive clones obtained from a previous library was verified. Thus, throughout sub-cloning activities, 54 positive subclones were obtained and the activity of 15 of them was confirmed by degrading Tween 20 and Tributyrin substrate. The presence of the inserts responsible for the lipolytic activity of the most active subclones was conformed via PCR. On the other hand, related to the cultivable component, three strains of the U. lactuca surface with very good lipolytic activity were obtained, where strain C11, a Vibrio alginolyticus, was found to be the most active. To sum up, the results of the present study allow understanding the genetic diversity that exists in the marine environments, mainly in green seaweeds. Thus, this would be the first report of lipolytic enzymes synthesized by epiphytic bacteria of Ulva lactuca in the Colombian Caribbean.