Evaluación del efecto de algunos elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares de Piper sp.

Abstract

Una de las principales limitantes en la investigación de los metabolitos secundarios aislados de plantas es la baja concentración producida en los organismos lo que dificulta la realización de investigaciones que generen aplicaciones a nivel industrial. El cultivo de células en suspensión proporciona una alternativa renovable, sostenible y respetuosa con el ambiente para incrementar la producción de estos compuestos bajo condiciones controladas. Una especie de interés de la que se han aislado en baja concentración sustancias con promisoria actividad antifúngica y antiparasitaria es Piper cumanense (Piperaceae), haciéndose importante emplear estrategias para obtener mayores cantidades de sus sustancias bioactivas. Dado el interés del grupo en los constituyentes químicos provenientes de P. cumanense, en la presente investigación se exploraron estrategias biotecnológicas para su producción en condiciones controladas mediante el establecimiento de algunas condiciones favorables de cultivos in vitro (inducción de callos y suspensiones celulares) y la evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de algunos metabolitos secundarios. Este trabajo comprendió el establecimiento de condiciones para la formación de callos a través del uso de reguladores de crecimiento vegetal en diferentes explantes (lámina y pecíolo) de plántulas germinadas in vitro. Posteriormente, se determinaron condiciones para el crecimiento de células en suspensión al utilizar callos friables, evaluando su acondicionamiento al medio líquido y el crecimiento de diferentes inóculos iniciales. Finalmente, se estableció el efecto de jasmonato de metilo (MeJA) y ácido salicílico (SA) como elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares de P. cumanense. En el establecimiento de condiciones para callogénesis se encontró que para la germinación in vitro de las semillas y posterior obtención de plántulas, es favorable para la esterilización hacer lavados previos con detergente y mayores tiempos de exposición con hipoclorito (10 min). El porcentaje de germinación se vio incrementado al usar AG3 (0.02 mg/L) en medios MS y al reducir el tiempo de siembra después de su recolección en campo. Los ensayos realizados con diferentes explantes (pecíolos y láminas) y diferentes combinaciones de auxina y citoquinina, permitieron determinar que el uso de pecíolo y una combinación de 2,4-D (1 mg/ L) y BAP (0,5 mg/L) produjeron los mejores callos friables. Los resultados de los estudios de actividad metabólica, cambios de acidez, producción de biomasa y cambio de color de las suspensiones celulares demostraron que hacer un recambio de medio 15 días después de establecidas las suspensiones permite mantener las células en un mejor estado fisiológico. Se estableció la curva de crecimiento de suspensiones con un inóculo de 90 g/L, obteniendo una tasa de crecimiento de 0,1097 ± 0,001477 día -1, un tiempo de duplicación de 6,319 días y una producción de biomasa favorable para los análisis cromatográficos. Finalmente, se determinó el efecto los elicitores MeJA y SA (10 y 100 µM) en la producción de metabolitos en extractos de células y medios de suspensiones celulares elicitadas encontrando una producción diferencial debida al efecto de estos inductores, apreciándose mayores cambios en el perfil al emplear SA. La expresión diferencial de los metabolitos secundarios fue más evidente en los medios de cultivo, destacándose los tratamientos con SA 100 µM, donde se logró una producción alta de los compuestos 5-hidroximetilfurfural (6,3%), fenol (6,5%) y (Z)-9-octadecenamida (8,8%), identificados tentativamente por GC-MS, y que fueron determinados como las variables de mayor peso en el análisis ACP. Con los elicitores empleados no se logró la producción de los metabolitos secundarios aislados previamente de P. cumanense. Las condiciones de cultivo in vitro establecidas pueden servir de base para la aplicación de diferentes estrategias para el aumento de la producción de metabolitos en P. cumanense y para el desarrollo de estudios biosintéticos.

One of the main limitations in research of secondary metabolites from plants is the low concentration produced in organisms, which makes difficult to carry out applications at industrial level. The suspension cell culture provides a renewable, sustainable and environmentally friendly alternative to increase the production of these compounds under controlled conditions. Piper cumanense (Piperaceae) is a species of interest from which have been isolated substances with promising antifungal and antiparasitic activity. However, these compounds have been obtained in low concentration, being important to search strategies to obtain greater amounts of bioactive substances. Given the interest of the research group in the chemical constituents from P. cumanense, this research explores biotechnological strategies for their production under controlled conditions by establishing some favorable culture conditions in vitro (induction of callus and cell suspensions) and the evaluation of the effect of elicitors on the production of some secondary metabolites. This work includes the establishment of conditions for callus formation using plant growth regulators in different explants (lamina and petiole) of germinated seedlings in vitro. Subsequently, the conditions for the growth of cells in suspension are determined by using friable callus, evaluating their conditioning to the liquid medium and the growth of different initial inoculums. Finally, it was evaluated the effect of methyl jasmonate (MeJA) and salicylic acid (SA) as elicitors on the production of secondary metabolites in cell suspensions of P. cumanense. In the establishment of conditions for callogenesis it was found that for in vitro germination of the seeds and subsequent obtaining of seedlings, it is favorable for sterilization to do previous washings with detergent and longer exposure times with hypochlorite (10 min). The germination percentage was increased by using AG3 (0.02 mg / L) in MS media and reducing planting time after harvesting in the field. The tests carried out with different explants (petioles and sheets) and different combinations of auxin and cytokinin, allowed to determine that the use of petiole and a combination of 2,4-D (1 mg/L) and BAP (0.5 mg/L) produced the best friable corns. The results of the studies of metabolic activity, acidity changes, biomass production and color change of the cell suspensions showed that making a change of media 15 days after the establishment of the suspensions allowed to keep the cells in a better physiological state. The suspension growth curve was established with an inoculum of 90 g/L, obtaining a growth rate of 0.1097 ± 0.001477 day -1, a doubling time of 6.319 days and a favorable biomass production for the analyzes chromatographic Finally, the effect of elicitors MeJA and SA (10 and 100 µM) on the production of metabolites in extracts of cell and media from elicited cell suspension was determined, finding a differential production due to the effect of these inducers, appreciating greater changes in the profile at employ SA. The differential expression of secondary metabolites was more evident in the culture media, highlighting the treatments with 100 µM SA, where a high production was achieved of 5-hydroxymethylfurfural (6.3%), phenol (6.5%) and (Z) -9-octadecenamide (8.8%)., tentatively identified by GC-MS, and which were determined as the variables of greatest weight in the PCA analysis. With the elicitors used, the production of the secondary metabolites previously isolated from P. cumanense was not achieved. The established in vitro culture conditions can serve as a basis for the application of different strategies for increasing the production of metabolites in P. cumanense and for the development of biosynthetic studies