Diseño de un medio de cultivo para el aislamiento y crecimiento de la bacteria productora de hidrógeno Ruminococcus albus

Abstract

Ruminococcus albus es una bacteria fibrolítica que ejerce una función importante en el fluido ruminal por su capacidad para degradar celulosa y hemicelulosa y por sus interacciones con otras especies. Asimismo, es un microorganismo con alto potencial biotecnológico por su capacidad para producir hidrogeno y porque puede ser usado como complemento dietario de ganado, pollos y caballos. A pesar de que esta bacteria se ha estudiado desde 1950, la mejora de medios de cultivo que permitan su aislamiento selectivo y específico a partir de fluido ruminal contribuiría a facilitar su estudio y aplicabilidad. El objetivo de este estudio fue optimizar un medio de cultivo para su aislamiento y crecimiento evaluando diferentes medios y agentes selectivos. En una primera fase se evaluó el método de roll-tube para aislar microorganismos celulíticos propuesta por Hungate (1969), utilizando carboximetilcelulosa (CMC) y papel filtro Whatman No1 (PMC) como fuentes de carbono en un medio modificado basado en el medio RGC (Rumen Fluid Glucose Cellobiose), identificando solo tres aislamientos de Streptococcus bovis/equinus en lugar de R. albus. En una segunda fase se evaluó el crecimiento de la cepa 7 de R. albus en el medio DSMZ 436 cuya reactivación tardó nueve días y los repiques crecieron después de 48 horas incubando a 37°C. Posteriormente se evaluó un medio químicamente definido, midiendo la tasa de crecimiento de las cepas 7, 8, SY3 y B199 que alcanzaron la fase exponencial tardía después de aproximadamente 10 horas de incubación a 37°C y 39°C. Adicionalmente se evaluó el crecimiento de las cepas en presencia de diferentes compuestos, con el fin de proponerlos como agentes selectivos. La cepa B199 creció después de 48 horas de incubación en presencia de ácido propiónico al 0.5% y LiCl al 0.5%, mientras que el resto crecieron antes de las 24 horas. Asimismo, todas las cepas crecieron en presencia de ácido nalidixico, exceptuando la cepa 8. Para estudios futuros se propone aislar R. albus usando fibra vegetal como fuente de carbono y probar la selectividad de estos tres agentes en el medio químicamente definido mediante la técnica de roll-tube y evaluar el crecimiento del microorganismo frente a otros posibles agentes selectivos como el feniletil alcohol entre otros. Del mismo modo se recomienda que para aislar, cultivar y criopreservar exitosamente este microorganismo es necesario tener en cuenta las características de su metabolismo y de su hábitat y seguir las recomendaciones sugeridas por la literatura para el trabajo en el laboratorio.

Ruminococcus albus is a fibrolytic bacterium which develops a key role in the rumen fluid due to its cellulose and hemicellulose degrading capability and interaction with other rumen microbiota species. Furthermore, is a high-biotechnological potential bacterium able to be used to produce hydrogen as energy source and as a dietary complement for poultry, cattle and horses as well. Therefore, despite of R. albus has been a research matter from 1950, a culture medium to be specifically isolated from rumen fluid would open the possibilities of study and applicability. The aim of this study was to optimize a selective culture medium for its growth and isolation by evaluating different media and selective agents. In a first stage, roll-tube methodology for isolation of cellulolytic bacteria proposed by Hungate (1969) using carboxymethyl-cellulose (CMC) and pebble-milled cellulose (PMC) as carbon sources, was evaluated in a RGC-based (Rumen Fluid Glucose Cellobiose) culture medium. Three ruminococci-shape isolates were identified as Strptococcus bovis/equinus instead R. albus. In a second phase, growth of R. albus strain 7 was evaluated in the medium DSMZ 436, in which reactivation took nine days and fresh inocula took 48 hours to growth. Both incubations were carried out at 37°C. Afterwards a chemical-defined medium was evaluated measuring the growth rate of R. albus strains 7, 8, SY3 and B199 which reached the late exponential phase before 10 hours of incubation at 37°C and 39°C. Subsequently the growth of the four strains was evaluated in the presence of several compounds with the aim to propose it as selective agents. The strain B199 grew after 48 hours of incubating time in the presence of 0.5% propionic acid and 0.5% LiCl, meanwhile the remaining strains have grown yet at 24 hours of incubation. All strains grew in the presence of 25 µg/mL of nalidixic acid as well, but strain 8 didn’t. For further studies it is proposed to isolate R. albus using vegetable fiber as carbon source and screening the selectivity of these agents in the chemical-defined medium by the roll-tube technique. However, the resistance to other selective agents of R. albus strains as phenyl-ethyl alcohol among others should be evaluated as well. Moreover, for a success isolation, growth and cryopreservation of R. albus it is recommended to take in consideration metabolic and habitat features of this microorganisms and follow the lab procedures as suggested in the literature.