Evaluación de isoespintanol y sericina como suplementos en los medios para la producción in vitro de embriones bovinos

Abstract

Una de las biotecnologías que ha tenido mayor impacto en la eficiencia productiva de los hatos es la producción in vitro de embriones bovinos. Sin embargo, se han encontrado falencias en los componentes utilizados en la preparación de medios en los laboratorios como el suero fetal bovino (SFB), que aunque aumenta la producción de embriones, genera dificultades en la criopreservación de embriones debido a la acumulación de lípidos en el citoplasma. De acuerdo con lo anterior, en el presente trabajo se usó la Sericina, una proteína extraída del gusano de seda, como alternativa al SFB. Así mismo, se conoce que el estrés oxidativo genera la alteración del ovocito y las células embrionarias en condiciones in vitro, por lo tanto, en esta investigación se empleó el isoespintanol, un antioxidante natural con gran capacidad de neutralización de las especies reactivas de oxígeno, con la finalidad de mejorar el proceso de producción in vitro de embriones bovinos y su tolerancia a la criopreservación. Se aspiraron ovocitos de folículos con tamaño de 3 a 8 mm de ovarios de hembras faenadas. Se seleccionaron los ovocitos viables de calidad 1 y 2, se pusieron en gotas de 100 ul de medio de maduración y se dejaron durante 22 a 24 horas en condiciones de 38.5°C y 5% de CO2. Se hicieron tres experimentos distribuidos de la siguiente manera: Primero se realizó la maduración in vitro (MIV) de los ovocitos con cuatro concentraciones de sericina, 0.1%, 0.5%, 1.0% y 2.5%. Se incluyó un tratamiento control con SFB y luego se seleccionaron las dos concentraciones con mayores tasas de MIV. Para el isoespintanol se evaluaron tres concentraciones hasta la expulsión del primer cuerpo polar: 10 µM, 20 µM y 30 µM. Para el segundo experimento, se seleccionaron las dos concentraciones con mejores resultados, que fueron 0.5% y 1.0%, para la sericina y 10 µM y 20 µM para el isoespintanol. Se realizó la MIV bajo seis tratamientos: T1 (10 % SFB) - control 1, T2 (Sin fuente de proteína) - control 2, T3 (sericina 0,5%), T4 (sericina 1%), T5 (isoespintanol 10 µM más 10% SFB), y T6 (isoespintanol 20 uM más 10% SFB). Después de 24 horas se realizó la fecundación in vitro durante 18–20 horas, se llevó a cabo la eliminación de las células del cúmulus y finalmente, los posibles cigotos se colocaron en medio de cultivo hasta etapa de blastocistos al día 7. Se obtuvo respuesta positiva en el reemplazo completo del SFB como fuente de proteína en los medios de maduración, obteniéndose mejores resultados con sericina al 1% e isoespintanol con 20 µM. Para el tercer experimento, se utilizó la misma combinación de las dos concentraciones de sericina e isoespintanol seleccionadas hasta etapa de blastocistos al día 7. Se establecieron tres tratamientos en la MIV: T1 (10% SFB) - control 1, T2 (sin fuente de proteína) - control 2 y T3 (1% de sericina más 20 µM de isoespintanol). En este último experimento, se encontró que la combinación de ambos componentes no arrojó resultados superiores con respecto a los tratamientos controles. Este trabajo concluye que la sericina podría usarse como fuente de proteína durante la MIV de los ovocitos bovinos, en reemplazo del suero fetal bovino. Así mismo, el isoespintanol puede utilizarse como suplemento antioxidante en los medios de maduración para la producción in vitro de embriones bovinos. (Texto tomado de la fuente)

One of the biotechnologies having the greatest impact on the productive efficiency of herds is the in vitro production of bovine embryos. However, shortcomings have been found in the components utilized in the preparation of media in laboratories such as bovine fetal serum (BFS), which, although it increases the production of embryos, it also generates difficulties in the cryopreservation of the embryos due to the accumulation of lipids in the cytoplasm. Considering that, this analysis uses Sericin, a protein extracted from silkworms, as an alternative to BFS. It has been known that oxidative stress generates an alteration to the oocyte and embryonic cells under in vitro conditions, therefore, this research uses isospintanol, a natural antioxidant with a the capacity to neutralize oxygen reactive species, in order to improve the in vitro production process of bovine embryos and its tolerance to cryopreservation. Oocytes from follicles with a size of 3 to 8 mm were extracted from ovaries of slaughtered females. Eligible oocytes with quality 1 and 2 were selected, placed in 100 ul drops of a maturation medium and left for 22 to 24 hours under conditions of 38.5°C and 5% CO2. Three experiments were completed as follows: First, in vitro maturation (“IVM”) of the oocytes was performed with four different concentrations of sericin, 0.1%, 0.5%, 1.0% and 2.5% and a BFS control treatment, then the two concentrations with the highest IVM rates were selected. For isospintanol, three concentrations were evaluated to the expulsion of the first polar body, 0 µM (Control), 10 µM, 20 µM and 30 µM. For the second experiment, the two concentrations with the best IVM results were selected, 0.5% and 1.0% for sericin and 10 µM and 20 µM for isospintanol. The IVM was performed under six treatments: T1 (10% BFS) – control 1, T2 (without protein source) – control 2, T3 (0.5% sericin), T4 (1% sericin), T5 (10 µM isospintanol plus 10% BFS), and T6 (20 uM isospintanol plus 10% BFS). After 24 hours of IVM, in vitro fertilization was performed for 18-20 hours, the cumulus cells were eliminated and finally, the possible zygotes were placed in a culture medium until day seven. A positive result was obtained in the complete replacement of BFS as a protein source in the maturation media, obtaining better results with 1% sericin and 20 µM isospintanol. For the third experiment, the same two concentrations of sericin and isospintanol were used to the blastocyst stage on day seven. Three IVM treatments were performed: T1 (10% FBS) – control 1, T2 (without protein source) - control 2, and T3 (1% sericin plus 20 µM isospintanol). In this last experiment, it was found that the combination of both components did not yield superior results with respect to the control treatments. This work concludes that sericin could be used as a protein source during IVM of bovine oocytes, in replacement of bovine fetal serum. It also concludes that isospintanol can be used as an antioxidant supplement in maturation media for the in vitro production of bovine embryos.