Estudio del efecto de quitinasas recombinantes como potenciadoras de la actividad insecticida de un aislamiento de Beauveria bassiana para el control de Diatraea saccharalis

Abstract

Las quitinasas son enzimas hidrolíticas provenientes de diferentes fuentes biológicas. En virus y hongos entomopatógenos, las quitinasas han sido reportadas como importantes factores de virulencia que cortan la estructura de la quitina presente en las dos principales barreras de protección de los insectos: la cutícula y la matriz peritrófica del intestino medio. Con el fin de estudiar el efecto de quitinasas recombinantes en la actividad insecticida de Beauveria bassiana sobre larvas de Diatraea saccharalis, en este trabajo se clonaron y expresaron en E. coli los marcos abiertos de lectura que codifican para las quitinasas Chit37 y Chit2A provenientes de los aislamientos colombianos Bv062 de B. bassiana y VG008 del granulovirus de Spodoptera frugiperda, respectivamente. La quitinasa fúngica recombinante (rChit37) purificada a partir de la fracción soluble del cultivo de células BL21-DE3, presentó actividad quitinolítica dual de tipo quitobiosidasa y endoquitinasa (EC 3.2.2.14) bajo condiciones óptimas de 45°C y pH 5.0. La rChit37 purificada potenció la actividad insecticida de B. bassiana sobre larvas de segundo instar de D. saccharalis; cuando se adicionó a una concentración de 300 µg/mL en una suspensión de 1x106 conidios/mL, se evidenció una reducción de 46% y 68% en los tiempos letales (TL50 y TL90) y un incremento de la eficacia en 61%. La proteína viral recombinante (rChit2A) presentó un dominio de unión a quitina en su secuencia, sin embargo, no se observó dominio catalítico, lo que se corroboró con la ausencia de actividad enzimática. Los hallazgos de este trabajo proveen una prueba concepto inicial para el estudio de quitinasas recombinantes en el desarrollo de futuras estrategias de potenciación de hongos entomopatógenos con potencial en el control biológico.

Chitinases are hydrolytic enzymes from different biological sources. In viruses and entomopathogenic fungi, chitinases have been reported as important virulence factors that cleave the chitin structure present in the two main protective barriers of insects: the cuticle and the peritrophic matrix of the midgut. In the present work, the open reading frames encoding chitinases Chit37 and Chit2A in the Colombian isolates Bv062 and VG008 of B. bassiana and the granulovirus of Spodoptera frugiperda, respectively, were cloned and expressed in E. coli to study the effect of recombinant chitinases on the insecticidal activity of Beauveria bassiana on larvae of Diatraea saccharalis. The recombinant fungal chitinase (rChit37) purified from the soluble fraction of the BL21-DE3 cell culture, displayed dual chitinolytic activity of the quitobiosidase and endochitinase types (EC 3.2.2.14) under optimal conditions of 45°C and pH 5.0. The purified rChit37 enhanced the insecticidal activity of B. bassiana on second instar larvae of D. saccharalis; a reduction of 46% and 68% in lethal times (TL50 and TL90) and an increase in efficacy by 61% was observed when added at a 300 μg/mL concentration in a suspension of 1x106 conidia/mL. The recombinant viral protein (rChit2A) showed a chitin binding domain in its sequence, however, no catalytic domain was observed, which was in agreement with the lack of enzymatic activity. The findings of this work provide an initial proof of concept for the study of recombinant chitinases in the development of future strategies of entomopathogenic fungal enhancement for biological control.