Implementación de una plataforma phage display para la producción de anticuerpos recombinantes anti-NAD+ quinasa de Plasmodium falciparum (PfNADK)

Abstract

La tecnología phage display permite la generación de librerías de anticuerpos monoclonales para su uso en investigación, diagnóstico y terapia. En este estudio, se reporta la construcción de una librería inmune de anticuerpos presentados en bacteriófagos, contra la enzima NAD quinasa de Plasmodium falciparum. La proteína NAD quinasa recombinante fue expresada en E. coli de forma completa y truncada, y esta última se purificó desde la fracción insoluble para la construcción de la librería. Los fragmentos variables de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos, se amplificaron desde ADNc de ratón y se clonaron en el fásmido pSEX81. La presentación de la librería se realizó sobre el bacteriófago ayudador M13KO7ΔpIII, con posterior selección por afinidad. Para la identificación de los bacteriófagos, se validó un ensayo de ELISA indirecto utilizando anticuerpos IgY. Los análisis por PCR indicaron la correcta clonación de las cadenas ligeras y pesadas en el fásmido, con un tamaño de librería de 1x107 cfu. El ensayo de ELISA indirecto permitió la detección de 3.6x106 pfu/mL. Después de tres rondas sucesivas de biopanning, con un enriquecimiento de más de 50 mil veces, se lograron aislar 6 bacteriófagos-scFv monoclonales específicos contra la proteína PfNADK. La evaluación de uno de los fagos-scFv demostró alta especificidad, con capacidad para detectar desde 8.4 ng de PfNADK. Adicionalmente, cuatro fragmentos scFv se caracterización mediante secuenciación de ADN, modelado tridimensional y acoplamiento molecular, sugiriendo así la posible interacción con la PfNADK que permite su reconocimiento específico. Finalmente, el uso de esta metodología es un punto de partida importante para la producción de anticuerpos recombinantes a nivel local, lo cual reduciría los costos de estos biológicos en nuestro país. (Texto tomado de la fuente)

Phage display technology enables the generation of monoclonal antibody libraries for use in research, diagnosis, and therapy. In this study, construction of an immune library of antibodies presented on bacteriophages, against the enzyme NAD kinase from Plasmodium falciparum is reported. Recombinant NAD kinase protein was expressed in E. coli in full-length and truncated form, and the latter was purified from the insoluble fraction for library construction. The variable fragments of heavy and light chains of the antibodies were amplified from mouse cDNA and cloned into the phagemid pSEX81. Library presentation was performed on the helper bacteriophage M13KO7ΔpIII, with subsequent affinity selection. For identification of bacteriophages, an indirect ELISA assay using IgY antibodies was validated. PCR analysis indicated correct cloning of the heavy and light chains in the phagemid, with a library size of 1x107 cfu. The indirect ELISA assay allowed the detection of 3.6x106 pfu/mL. After three successive rounds of biopanning, with an enrichment of more than 50 thousand times, it was possible to isolate 6 specific monoclonal bacteriophage-scFv against the PfNADK protein. The evaluation of one of the phage-scFv demonstrated high specificity, with the capacity to detect 8.4 ng of PfNADK. Additionally, four scFv fragments were characterized by DNA sequencing, three-dimensional modeling, and molecular docking, thus suggesting the possible interaction with PfNADK that allows its specific recognition. Finally, the use of this methodology is an important starting point for the production of recombinant antibodies at the local level, which would reduce the costs of these biologics in our country.