Análisis de los perfiles de expresión de genes relacionados con vías de proliferación celular en Fibroblastos de Calvaria de una muestra de pacientes colombianos con Síndrome de Apert posterior a la degradación Heparán Sulfato

Abstract

Objetivo: La activación de FGFR2 requiere una configuración entre ligando, receptor y Heparan sulfato (HS). Mutaciones en este receptor afectan el balance proliferación/diferenciación de células osteoprogenitoras ocasionando craniosinostosis. Se postula que degradar HS en tejido perióstico de pacientes con Síndrome de Apert podría alterar la expresión génica relacionada con vías de proliferación celular y modular el comportamiento celular. Métodos: Fibroblastos periósticos de tres pacientes y un control fueron cultivados y estimulados con FGF2 por 24h y Elaprase®(0.025mg/ml) por 48h. A partir del RNA total se determinó la expresión génica con el Genechip® Human Gene 2.0ST Array(Affymetrix). Las diferencias se establecieron con fold change |2|. Los genes fueron anotados usando DAVID(v.6.7). Correcciones al p valor se realizaron con los test de Bonferroni, Benjamini, FDR. Algunos genes de interés se validaron mediante qRT-PCR. Resultados: Los genes de interés diferencialmente expresados a la alta, asociados a proliferación celular fueron: MMP13, F3, IGF1, IGFBP3, DDX46, DAPL1, SERPINB2 y FGF2 y a la baja: MTRNR2L2, PTPRB, ATG9A, MAP3K1, COMP, CDH13, TP53TG3, TERF2IP, FGF7, FGF10, PPP2R2B. RUNX2, AKR1B15. Los genes validados por medio de qRT-PCR fueron MMP1, CDH3, FGFBP3 y PTPRB.Los cuales corroboran lo encontrado en el microarray. Conclusión: El tratamiento modificó la expresión génica relacionada con matriz extracelular y los procesos de proliferación y diferenciación celular. El mayor impacto se evidenció en los genes asociados a matriz extracelular generando supra-regulación para cadherinas/protocaderinas e infra-regulación para metaloproteinasas lo cual contrasta con los modelos previos de la enfermedad. Se propone una recuperación parcial del microambiente celular después del tratamiento.

Abstract. Objective: FGFR2 activation requires a tridimensional configuration between ligand, receptor and Heparan sulfate (HS). FGFR2 mutations affects the osteoprogenitor cells balance between proliferation and differentiation processes, leading to craniosinostosis. We postulate that periostic tissue-HS degradation in AS patients alters the cellular proliferation ways-related gene expressionand could modulate the cell behavior. Methods: Periostic AS fibroblasts from 3 subjects and 1 healthy control were cultivatedand stimulated with FGF2 for 24h and with Elaprase® (0.025mg/ml) for 48h by triplicate. Total RNA (50ng/uL) was obtained to validate the relative expression using the Genechip® Human Gene 2.0 ST Array (Affymetrix). The differences in gene expression level were established with fold change |2|. The data analysis was performed using DAVID (v.6.7). The p value corrections were made with Bonferroni, Benjamini and FDR tests. Some genes were validated by qRT-PCR. Results: The cellular proliferation ways-related upregulated geneswere: MMP13, F3, IGF1, IGFBP3, DDX46, DAPL1, SERPINB2 y FGF2 and downregulated: MTRNR2L2, PTPRB, ATG9A, MAP3K1, COMP, CDH13, TP53TG3, TERF2IP, FGF7, FGF10, PPP2R2B. RUNX2, AKR1B15. The genes validated through qRT-PCR were MMP1, CDH3, FGFBP3 y PTPRB, these corroborated the microarray findings. Conclusion: Elaprase treatment modifies the ECM elements expressionand the proliferation/differentiation processes. The bigger impact was evidenced in gene groups EMC-related, generating downregulation for cadherin/protocadherin and upregulation for matrix metalloproteinases. This data contrasts with previous AS models reports. We propose a probable partial extracellular microenvironment recuperation after treatment.