Análisis molecular escalonado para la identificación de mutaciones en Hemofilia A y la correlación genotipo-fenotipo en una muestra de pacientes de Bogotá, D.C. Colombia

Abstract

La Hemofilia A es el segundo trastorno de la hemostasia más común después de la enfermedad de von Willebrand, con incidencia mundial de 1:5000 nacidos vivos varones y de herencia recesiva ligada al cromosoma X. Se estima que hay aproximadamente 178,500 personas con la enfermedad, el 60% presenta la forma severa. La inversión del intrón 22 y del intrón 1 representan las principales alteraciones moleculares en pacientes con hemofilia A severa, con frecuencia del 45-50% y 0.5-5%, respectivamente. Hemos implementado una estrategia para la identificación de la alteración molecular en cada paciente con HA mediante Inverse shifting PCR para la identificación de las inversiones de los intrones 22 y 1, seguido del análisis de los exones del gen F8 en pacientes que no presenten inversión mediante PCR-High Resolution Melting y posteriormente secuenciación Sanger en aquellos exones que presenten alteración en PCR-High Resolution Melting. Se analizaron 37 individuos masculinos con Hemofilia A (30 severos, 5 moderados y dos leves) de dos centros de tratamiento integral de hemofilia de los cuales 33 son no relacionados y 8 mujeres (6 madres y dos hermanas de pacientes). Se identificó la inversión 22 en 14 de 33 (42.4%), en 3 de 33 (9.1%) la inversión 1, en 3 de 33 pacientes (9.1%) gran deleción y en 11 de 33 (33.3%) variaciones puntuales o pequeñas deleciones. Dos variantes tipo missense no han sido reportadas previamente, una en un individuo con Hemofilia A severa (c.262AG; p.M88V) y otra variante en dos hermanos con Hemofilia A leve (c.5666AG; p.Q1889R) así como una variante nonsense (c.399TA; p.Y133*) en un paciente con HA severa. No se identificó la variante patogénica causal en 2 de 33 individuos (6%). Con este abordaje molecular escalonado costo-efectivo hemos identificado, por primera vez en Colombia, la variante patogénica responsable de Hemofilia A en 31 de 33 pacientes no relacionados (94%).

Abstract. Hemophilia A (HA) is the second most common hemostasis disorder after von Willebrand disease, with a worldwide incidence of 1: 5000 live births with an X-linked recessive inheritance. It is estimated that approximately 178,500 people are affected with the disease; 60 % with the severe form. Intron 22 and intron 1 inversions represent the major molecular alterations found in severe hemophilia A patients, 45-50% and 0.5-5%, respectively. We have implemented a strategy for the identification of the molecular alteration in each patient with HA by Inverse shifting PCR for the identification of the inversions of introns 22 and 1, followed by the analysis of the F8 gene exons by means of PCR -High Resolution Melting and Sanger sequencing in patients who do not present inversion. A total of 37 male HA patients (30 severe, 5 moderate and 2 mild) from two comprehensive hemophilia treatment centers were analyzed, 33 of whom were unrelated and 8 women (6 mothers and 2 sisters). Inversion 22 was identified in 14 of 33 (42.4%), 3 of 33 (9.1%) had inversion 1, 3 of 33 patients (9.1%) presented large deletions and 11 of 33 (33.3%) had point variations or small deletions. Two missense variants have not been previously reported, one in an individual with severe HA (c.262AG; p.M88V) and another variant in two siblings with mild HA (c.5666A G; p.Q1889R). In addition, a nonsense variant (c.399TA; p.Y133*) in a patient with severe HA has not been described before. No pathogenic variant was identified in 2 of 33 individuals (6%). With this cost-effective systematic molecular approach we have identified, for the first time in Colombia, the pathogenic variant responsible for Hemophilia A in 31 of 33 unrelated patients (94%).