Implementación y optimización del proceso sintético para el cambio del contraión de trifluoroacetato a clorhidrato o acetato en péptidos sintéticos derivados de LfcinB

Abstract

Se han identificado péptidos que hacen parte de la primera línea de defensa de los organismos (respuesta inmune innata) frente a patógenos y se conocen péptidos antimicrobianos (PAMs). Algunos PAMs ejercen efecto citotóxico en líneas celulares humanas derivadas de diferentes tipos de cáncer, por lo que se conocen como péptidos anticancerígenos (PACs). En la etapa de identificación de moléculas promisorias generalmente los péptidos son obtenidos mediante síntesis química en fase sólida utilizando la estrategia Fmoc/tBu y purificados por extracción en fase sólida RP-SPE, utilizando como par iónico el ácido trifluoroacético. Sin embargo, la mayoría de los fármacos son comercializados con el contraión clorhidrato o acetato, siendo el trifluoroacetato menos frecuente debido a su toxicidad. En esta investigación se diseñaron, desarrollaron e implementaron metodologías para intercambiar el ion trifluoroacetato por clorhidrato o acetato. Para esto se seleccionaron los PACs/PAMS promisorios: Los péptidos (RRWQWRRLLR)2K-Ahx, (RRWQWRFKKLG)2K-Ahx, KKWQWK-Ahx-RLLRRLLR y RRWQWRRWQWR. En primer lugar, estos péptidos se obtuvieron en forma de sal, siendo el contraión el ión trifluoroacetato (CF3COO-). Se identificaron los pasos críticos del proceso y se establecieron las condiciones óptimas para el cambio del contraión de los péptidos, siendo la metodología optimizada eficiente, rápida, de bajo costo y amigable con el medio ambiente. Adicionalmente, se desarrolló una metodología novedosa por RP-SPE para el intercambio del contraión en un solo proceso. El intercambio del contraión fue monitoreado y los productos finales fueron caracterizados por RP-HPLC, LC-MS, RMN y FT-IR. Los resultados indican que el intercambio del contraión no afectó la integridad ni identidad del péptido.

Por otro lado, se evaluó la actividad antimicrobiana de los péptidos en cepas de E. coli y S. aureus y el efecto citotóxico en líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y de cuello uterino HeLa. Se determinó que el cambio del contraión no afectó la actividad antibacteriana ni la actividad anticancerosa de los péptidos. Los resultados sugieren que los métodos desarrollados pueden ser implementados de manera rutinaria en la síntesis de péptidos en fase sólida y que el cambio del contraión puede ser realizado de manera eficiente, independiente de las propiedades fisicoquímicas de los péptidos como la longitud, polaridad, polivalencia, presencia de aminoácidos no naturales o moléculas no proteicas. (Texto tomado de la fuente).

Peptides have been identified as part of the organism's first line of defense (innate immune response) against pathogens and are known as antimicrobial peptides (AMPs). Some AMPs exert cytotoxic effects on human cell lines derived from different types of cancer and are therefore known as anticancer peptides (ACPs). In the stage of identifying promising molecules, peptides are generally obtained by solid-phase chemical synthesis using the Fmoc/tBu strategy and purified by solid-phase extraction (RP-SPE), using trifluoroacetic acid as the ion pair. However, most drugs are marketed with the counterion hydrochloride or acetate, with trifluoroacetate being less common due to its toxicity. In this research, methodologies were designed, developed, and implemented to exchange the trifluoroacetate ion for hydrochloride or acetate. For this purpose, the following promising PACs/PAMS were selected: the peptides (RRWQWRRLLR)2K-Ahx, (RRWQWRFKKLG)2K-Ahx, KKWQWK-Ahx-RLLRRLLR, and RRWQWRRWQWR. These peptides were first obtained in salt form, with the counterion being the trifluoroacetate ion (CF3COO-). Critical process steps were identified, and optimal conditions for peptide counterion exchange were established. The optimized methodology was efficient, rapid, low-cost, and environmentally friendly. Additionally, a novel RP-SPE methodology was developed for single-process counterion exchange. Counterion exchange was monitored, and the final products were characterized by RP-HPLC, LC-MS, NMR, and FT-IR. The results indicate that counterion exchange did not affect the integrity or identity of the peptide.

Furthermore, the antimicrobial activity of the peptides was evaluated against E. coli and S. aureus strains, and the cytotoxic effect was assessed against MCF-7 breast cancer and HeLa cervical cancer cell lines. It was determined that the counterion exchange did not affect the antibacterial or anticancer activity of the peptides. The results suggest that the developed methods can be routinely implemented in solid-phase peptide synthesis and that the counterion exchange can be performed efficiently, independent of the physicochemical properties of the peptides, such as length, polarity, polyvalence, presence of unnatural amino acids, or non-protein molecules.