Inmovilización de lipasa candida rugosa en soporte de quitosano

Abstract

Se llevó a cabo la producción de un sistema biocatalítico con características físico químicas adecuadas, para ser aplicado en reacciones de hidrólisis y esterificación. El soporte de inmovilización fue fabricado a partir de un hidrogel macroporoso de quitosano con concentración de 3 % el cual se sometió a un proceso de criogelificación-crioconcentración por un tiempo de 4-5 días, produciéndose en diferentes geometrías. Finalmente se escogió la forma cilíndrica ya que los pellets resultaron de fácil producción, resistentes a la abrasión y a la agitación. La humedad final de los soportes cilíndricos fue de alrededor del 17% . Una solución de glutaraldehido fue utilizada como activador del soporte utiizando el método de brazo espaciador. El valor óptimo de carga enzimática la produjo un tratamiento de activación con glutaraldehido al 0.003 %, La inmovilización de lipasa cándida rugosa (CRL) fue llevada a cabo por inmersión del soporte activado en una solución de la proteína durante 15h. Así se obtuvo una carga de 1.065 mg enzima/ g soporte seco, en promedio. La caracterización del soporte se llevó a cabo por medio de espectroscopia de infrarrojo (FTIR) hallando un grado de D-acetilación de 68.86%. La morfología externa fue estudiada por microscopia de fuerza atómica en modo de contacto encontrándose un tamaño medio de poro de 195 ± 560 nm y rugosidades medias de 229 ± 308 nm para el soporte obtenido a partir de la solución del 3% de quitosano. La resistencia a la agitación y la solubilidad-degradabilidad fue estudiada, encontrándose resistente a agitaciones hasta de 1100 rpm y soluble solo en soluciones de ácido acético. El grado de hinchamiento se evaluó para la hidrólisis encontrándose que el soporte se hincha en un 77.16 % al cabo de 96h. La caracterización del sistema biocatalítico se llevó a cabo por hidrólisis de aceite de oliva y mediante la esterificación de ácido oleico con n-butanol, presentándose una mayor actividad de la enzima inmovilizada con respecto a la enzima libre con valores de 14.79 U/mg y 9.69 U/mg respectivamente. Este trabajo forma parte del proyecto de investigación “Producción de Biodiesel a partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reacción-separación por enzimas Inmovilizadas” adscrito a Colciencias. / Abstract: The aim of this work was the production and characterization of an adequate catalytic system for hydrolisis and esterification reactions. As a support it was used different pellet shapes of a a macroporous dried hydrogel (ca 17% humidity, wet basis) obtained from a chitosan dispersion (3% wt) gelled at 20ºC, crioconcentrated at -20ºC and thawed at 20ºC. Easy way of production, good abrasion and agitation resistance was the principal reasons to choose the cylinders as the final shape of the pellet. Candida Rugosa Lipase – CRL- was immobilized on the chitosan support after immersion contact for 15 h with an enzyme solution .Glutaraldehyde was used as activation agent or spaced arm in the lipase immobilization process. Activating glutaraldehyde solution (0.003% wt) yield higher enzymatic load on chitosan pellets (average value of 1.065 mg enzyme/ g of dried support). Support characterization included infrared spectroscopy – FTIR- for deacetylation degree (68.86%) and atomic force microscopy – contact mode- for roughness (between 229 and 308 nm) and pore size (149 to 226 nm). Agitation resistance and swelling in water and solubility in different media were also studied. Pellets had a good behavior in agitated environment until 1100 rpm; they were dissolved in acetic acid solutions. It was measured 77.6% of swelling after 96 h in contact with aqueous hydrolysis reaction media solutions Hydrolysis and esterification catalytic activity was made in olive oil hydrolysis and n-butanol - oleic acid reaction respectively. Supported lipase system showed higher enzymatic activity than free enzyme catalyzed reactions (14.79 U/mg y 9.69 U/mg forr hydrolysis and esterification respectively). This work is a part of a major research project called “Producción de Biodiesel a partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reacción-separación por enzimas Inmovilizadas” with finantial support of Colciencias and Universidad Nacional Sede Manizales.