Estudio de los microesclerocios formados por el hongo entomopatógeno Metarhizium robertsii Mt004: Producción, caracterización y actividad insecticida

Abstract

Los conidios son las estructuras fúngicas más comúnmente utilizadas como ingrediente activo para el desarrollo de bioplaguicidas. Sin embargo, diferentes problemas asociados con su producción masiva en fermentación sólida, su manipulación a gran escala, y la susceptibilidad a condiciones ambientales, que resulta en una baja persistencia en campo, han motivado la investigación en torno al uso alternativo de otros propágulos fúngicos. Los microesclerocios (ME) son propágulos con gran potencial para el desarrollo de bioplaguicidas más persistentes y fáciles de producir, debido a sus características de resistencia, capacidad de germinación y de producción de conidios infectivos de insectos. Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo principal de este trabajo fue inducir la producción de microesclerocios con la cepa de Metarhizium robertsii Mt004 y estudiar el proceso de formación, estructura, composición, fisiología y potencial insecticida. Para ello, inicialmente se realizó la identificación a nivel de especie la cepa de Metarhizium sp. Mt004 (previamente seleccionada por su alta virulencia frente varios insectos plaga) y se desarrollaron las condiciones para inducir la formación de microesclerocios en cultivo sumergido. Los ME se caracterizaron en cuanto a su estructura, composición, fisiología y actividad biocontroladora; y finalmente se buscó la identificación de metabolitos producidos durante la producción de los ME que puedan tener actividad insecticida.

El aislamiento Mt004 fue identificado molecularmente como Metarhizium robertsii mediante el análisis basado en las secuencias de la región espaciadora interna transcrita del ADN ribosomal (ITS), el factor de elongación 1-alfa (EF-1α) y la región beta tubulina (β-tubulina). Para la producción de ME se evaluaron cuatro medios de cultivos con diferentes relaciones Carbono:Nitrógeno (C:N). El medio de cultivo “D” fue seleccionado por producir el mejor rendimiento de ME (2,04x103 ME/mL) con posterior producción de conidios (6,02x105 conidios/ME). Los ME obtenidos en cultivos de 20 días se caracterizaron morfológica, ecofisiológica, química y biológicamente. La observación ultraestructural de los ME evidenció la presencia de hifas intrincadas en el inicio de su formación, hasta conformar una estructura compacta cimentada en una matriz extracelular amorfa. En el análisis composicional de las estructuras no se detectó la presencia de trehalosa, pero si se confirmó la presencia de pequeñas concentraciones de manitol; y los espectros de Resonancia Magnética Nuclear sugirieron la presencia de otros carbohidratos que podrían servir como reservas energéticas para garantizar la sobrevivencia de los ME.

En comparación con los conidios, los ME presentaron mayor resistencia a condiciones de estrés ambiental como temperatura y la radiación UV. De forma similar, los ME fueron más estables que los conidios bajo condiciones de almacenamiento a diferentes temperaturas (8, 18 y 28 °C), manteniéndose viables después de ser almacenados por 6 meses a 8°C, mientras que los conidios no germinaron después de 2 meses a ninguna de las temperaturas evaluadas. La actividad insecticida de los conidios producidos por los ME fue evaluada utilizando larvas de Diatraea saccharalis como insecto modelo, con el cual se obtuvo un 78% de eficacia que sugiere que los conidios producidos por estas estructuras son propágulos altamente virulentos. La evaluación de la actividad insecticida de los metabolitos liberados al medio de fermentación durante la producción de los ME mostró una eficacia cercana al 50% sobre larvas de D. saccharalis cuando se utilizaron el medio libre de células y la fracción orgánica FO.

Los datos de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) obtenidos para la FO fueron usados en la construcción de redes moleculares utilizando la plataforma GNPS (Global Natural Product Molecular Networking Social). Los análisis identificaron compuestos con homología con la familia de los ciclodepsipéptidos sugiriendo la presencia de 24 destruxinas, entre las que se encuentran la destruxina A, A2, B reconocidas por su actividad insecticida.

Los resultados obtenidos en este trabajo muestran el potencial de los ME de M. robertsii, y de los metabolitos liberados al medio durante su producción, para ser usados como principio activo de un bioplaguicida con óptimas características de eficacia, estabilidad y tolerancia a condiciones abióticas. Esto sumado a que su producción se realiza mediante fermentación sumergida que es un proceso sencillo, escalable, replicable y de fácil control, hace que esta tecnología sea ideal para el futuro desarrollo de un bioplaguicida novedoso, eficiente y con alta factibilidad técnica y económica.

Conidia are commonly used as the active ingredient for biopesticide development. However, conidia performance in field is drastically affected by abiotic factors, which added to its laborious production using solid fermentation (SSF) have motivated the search for novel fungal propagules. Microsclerotia (ME) are fungal propagules formed by compact and pigmented aggregates of mycelium, highly tolerant to desiccation, and able to produce infective conidia. In this work, the main objective to induce the Metarhizium robertsii microsclerotia production and study the ME formation process, ME structure, composition, physiology, and insecticidal activity. Firstly, we identified the strain of Metarhizium sp. Mt004 (previously selected for its high virulence against several insect pests) and developed the conditions to induce the formation of microsclerotia in submerged culture. We also studied the ME formation process, ME structure, composition, physiology, and insecticidal activity; as well as the metabolites with insecticidal potential produced during MS formation. The isolate Mt004 was clustered in the same clade with Metarhizium robertsii based on genomic multilocus (ITS, EF-1α, and β-tubulin). For ME production, four culture media with different Carbon: Nitrogen (C:N) ratios was evaluated. Culture medium "D" was selected for reaching the highest yield (2.04x103 ME/mL) with subsequent production of conidia of 6.02x105 conidia/ME. ME harvested after 20-day of fermentation were then morphologically, ecophysiologically, chemically and biologically characterized. The ultrastructural analysis revealed the presence of intricate hyphae at the beginning of the formation process and a few live cells embedded in a compact extracellular matrix were observed in mature structures. The compositional analysis showed the presence of small concentrations of mannitol whereas trehalose was not detected, but Nuclear Magnetic Resonance spectra suggested the presence of other carbohydrates that could serve as energy reserves to guarantee the ME survival. ME were more tolerant to heat and UV radiation than conidia produced by SSF. Similarly, ME were more stable than conidia under storage conditions at different temperatures (8, 18 and 28 °C), remaining viable after 6 months of storage at 8 °C, while conidia produced by SSF died after 2 months of storage at all temperatures evaluated. The ME-derived conidia caused 78% mortality of Diatraea saccharalis larvae, suggesting that conidia produced by ME are highly virulent propagules. Insecticidal activity of metabolites released into the broth during microsclerotia formation showed efficacies around 50% against D. saccharalis larvae when the fungus-free supernatant and the organic fraction were used. The tandem mass spectrometry (MS/MS) data obtained for the organic fraction were used in the construction of molecular networks using the GNPS (Global Natural Product Molecular Networking Social) platform. The majority of compounds in the organic fraction were from the cyclodepsipeptide family, suggesting the presence of 24 destruxins, including destruxin A, A2 and B, which have been previously recognized for their insecticidal activity. The results obtained in this work show the potential of ME from M. robertsii and the metabolites released during their production, to be used as an active ingredient of a biopesticide with optimal characteristics of efficacy, stability and tolerance to abiotic conditions. This, added to the fact that its production is carried out by submerged fermentation, which is a simple, scalable, replicable and easily controlled process, makes this technology ideal for the future development of a novel, efficient biopesticide with high technical and economic feasibility.