Construyendo el metabolismo del NAD(P)+ en Plasmodium falciparum: estudio de la NADK y la NMNAT

Abstract

La Nicotinamida/Nicotinato monucleótido adenililtransferasa (NMNAT) y la Quinasa del Dinucleótido de adenina y Nicotinamida (NADK) son dos enzimas centrales en el metabolismo del NAD+, la primera de ellas esencial para su síntesis y la segunda para su fosforilación generando NADP+. En el parásito protozoo P. falciparum los dos dinucleotidos (NAD+ y NADP+) están implicados en procesos vitales para su supervivencia como; defensa contra estrés oxidativo, vía pentosas fosfato, síntesis de ácidos grasos, entre otros. La enzima NADK en P. falciparum aún no se ha identificado, desconociéndose gran parte de la ruta de síntesis del NADP+. Los resultados obtenidos en esta tesis permitieron proponer un candidato a NAD quinasa en el parásito (PfNADK). A nivel computacional se identificó la secuencia primaria de la proteína, motivos funcionales y se realizaron predicciones de la estructura tridimensional del candidato PfNADK, comparándola con otras NADKs ya caracterizadas. Los resultados experimentales permitieron obtener clones de expresión de la proteína recombinante, expresar y purificar fragmentos del candidato en el sistema heterólogo E. coli y determinar posibles motivos funciones esenciales en la actividad NAD quinasa de la enzima. Adicionalmente se diseñó una herramienta inmunología para su reconocimiento en extractos asincrónicos del parásito con la producción de anticuerpos policlonales aviares y murinos, detectando una proteína con posible localización citosólica de 76kDa cuyo tamaño molecular corresponde al esperado para el candidato propuesto PfNADK. En cuanto a la NMNAT, en trabajos previos de nuestro grupo se realizó la caracterización de la enzima en P. falciparum optimizando expresión, solubilidad de la proteína recombinante y relevancia de secuencias específicas de la proteína mediante la construcción de mutantes de la PfNMNAT. Dando continuidad al estudio de esta enzima en este trabajo de investigación se buscó un acercamiento a su estructura tridimensional por ensayos preliminares de cristalografía de rayos x, los cuales permitieron optimizar la purificación de la proteína y determinar condiciones óptimas para la posible obtención de cristales como una aproximación hacia su análisis estructural.