Evaluación de la actividad antagonista de mutantes aleatorios de la cepa Bacillus velezensis IBUN 2755 contra hongos fitopatógenos de arroz

Abstract

Bacillus velezensis IBUN 2755 es una cepa aislada de la rizosfera de Solanum phureja (papa criolla), que ha demostrado en estudios previos, actividad antagonista contra los hongos fitopatógenos Rhizoctonia solani y Gaeumannomyces graminis, fitopatógenos asociados al cultivo de arroz. No obstante, los mecanismos de acción de la cepa aún no se conocen con precisión. Para dilucidar estos mecanismos, se empleó una estrategia de mutagénesis aleatoria en la cepa silvestre utilizando irradiación con luz ultravioleta (UV). El objetivo principal de este estudio fue generar y evaluar mutantes de B. velezensis IBUN 2755. Para ello se realizó un tamizaje in vitro del antagonismo de 145 mutantes putativos, identificándose la cepa mutante 39A, la cual mostró una disminución significativa en la actividad inhibitoria, del 51,9% contra G. graminis y 51,1% contra R. solani. Asimismo, se evidenció que a partir del sobrenadante del medio de cultivo (MOLP), la cepa se presentó una disminución en la actividad inhibidora frente a ambos hongos. Posteriormente se analizó el perfil metabólico de la cepa a partir de extractos del sobrenadante mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), esto reveló diferencias en los perfiles cromatográficos entre la cepa silvestre y la mutante. En particular, se observó la pérdida de un pico asociado a compuestos de tipo fengicina, según un patrón comercial. Para comprobar estos compuestos se utilizó la técnica HPLC MS/MS a partir de esto se evidenció cambios en el perfil cromatográfico encontrándose ausencias en el compuesto denominado Lipopeptide N°56362, sin embargo, también se encontró diferencias en la intensidad de compuestos de tipo Bacillopeptina, Surfactina y un compuesto de la familia de las fengicinas. Otras características fenotípicas encontradas fueron: cambios en la morfología la cual difirió con respecto a la cepa control. Además, al evaluar su curva de crecimiento hasta las 72 horas, se evidenció un crecimiento similar, para la estabilidad de la mutante en el tiempo se evaluaron hasta 10 generaciones encontrándose que la mutación fue estable en todas; adicionalmente se evaluó la actividad antagonista de compuestos orgánicos volátiles (VOCs) producidos por la cepa mutante, demostrando que esta perdió parcialmente su capacidad inhibitoria en comparación con la cepa silvestre. Finalmente, el genoma de la cepa 39A fue secuenciado mediante la tecnología Illumina, identificándose 23 SNPs en genes relevantes como spo0A, el cual codifica el regulador maestro de la esporulación, también se identificó otros SNPs de interés como en los genes pksF, el cual codifica un módulo de una sintetasa de policétidos y ppsA que codifica el módulo A de la sintetasa de fengicinas y por lo tanto pueden afectar la producción de dichos compuestos. Se concluye que compuestos de la familia de las fengicinas podrían estar asociados a la actividad antagonista de la cepa IBUN 2755 contra hongos fitopatógenos de arroz. (Texto tomado de la fuente).

Bacillus velezensis IBUN 2755 is a strain isolated from the rhizosphere of Solanum phureja (criolla potato) that has previously demonstrated antagonistic activity against the phytopathogenic fungi Rhizoctonia solani and Gaeumannomyces graminis, pathogens associated with rice cultivation. However, the strain's mechanisms of action remain unclear. To elucidate these mechanisms, a random mutagenesis strategy was applied to the wild-type strain using ultraviolet (UV) irradiation. The primary objective of this study was to generate and evaluate B. velezensis IBUN 2755 mutants. To achieve this, an-in vitro screening of 145 putative mutants was performed, identifying the mutant strain 39A, which exhibited a significant reduction in inhibitory activity: 51.9% against G. graminis and 51.1% against R. solani. Additionally, supernatant from the MOLP culture medium showed a decrease in inhibitory activity against both fungi. Subsequently, the strain's metabolic profile was analyzed using high-performance liquid chromatography (HPLC) of supernatant extracts, revealing differences between the wild-type and mutant strains. Notably, the mutant strain exhibited the loss of a peak associated with fengycin-type compounds, based on a commercial standard. To confirm these findings, HPLC-MS/MS analysis was conducted, revealing alterations in the chromatographic profile, from this, changes were evidenced, with the absence of the compound named Lipopeptide N°56362. However, differences were also found in the intensity of compounds belonging to the Bacillopeptin, Surfactin, and a compound from the Fengycin family. Other phenotypic characteristics included morphological changes compared to the control strain. Additionally, growth curve analysis up to 72 hours showed similar growth patterns. The mutant strain's stability over time was assessed across 10 generations, confirming that the mutation remained stable. Furthermore, the antagonistic activity of volatile organic compounds (VOCs) produced by the mutant strain was evaluated, demonstrating a partial loss of inhibitory capacity compared to the wild-type strain. Finally, the genome of strain 39A was sequenced using Illumina technology, identifying 23 SNPs in relevant genes, including spo0A, which encodes the master regulator of sporulation. Other noteworthy SNPs were found in pksF, which encodes a module of a polyketide synthase, and ppsA, responsible for encoding module A of fengycin synthase, potentially affecting the production of these compounds. In conclusion, fengycin-family compounds may be associated with the antagonistic activity of B. velezensis IBUN 2755 against rice phytopathogenic fungi.