Secuenciación dirigida de nueva generación como estrategia para el diagnóstico de tuberculosis resistente a medicamentos en Colombia

Abstract

Introducción: La tuberculosis continúa siendo un problema de salud pública de gran magnitud a nivel global; a pesar de que es una enfermedad prevenible y curable, para el año 2023, se convirtió en la principal causa de muerte en el mundo ocasionada por un solo agente infeccioso, superando al COVID-19. La Organización Mundial de la Salud (OMS) reportó 400 mil casos de tuberculosis resistente a rifampicina (RR) y multirresistente (TB-RR/MDR), con un incremento notable para América y el Sudeste Asiático. En la región de las Américas, se estima que se presentan hasta 15 mil casos de TB-RR/MDR anualmente; sin embargo, solo el 61% de los casos nuevos y el 68% de los previamente tratados tienen acceso a pruebas de susceptibilidad para rifampicina, y menos del 20% acceden a pruebas de susceptibilidad para fluoroquinolonas a pesar de que existen sistemas de vigilancia utilizando pruebas a susceptibilidad a fármacos usando métodos fenotípicos y genotípicos basados en PCR, que presentan limitaciones de masificación, implementación y tiempos de respuesta. Colombia está entre los diez países de América con mayor número de casos notificados de TB- RR/MDR. En 2022, el Instituto Nacional de Salud (INS) informó que, de 17.595 casos de tuberculosis identificados, 473 (2,7%) fueron de TB farmacorresistente, lo que representa un incremento del 33% en comparación con 2021. Objetivo: Evaluar un panel de secuenciación dirigida de próxima generación por Oxford Nanopore para el diagnóstico de tuberculosis resistente a medicamentos en Colombia, como método complementario a la vigilancia de la resistencia a los medicamentos. Metodología: se realizó un estudio experimental para el diseño y estandarización de un panel de secuenciación de nueva generación usando la tecnología Oxford Nanopore para la determinación de susceptibilidad a medicamentos usados para el tratamiento de la TB sensible y farmacorresistente en Colombia. El panel fue comparado con los métodos de referencia para pruebas de susceptibilidad en TB (pruebas fenotípicas en medio líquido) y para secuenciación de genoma por la tecnología de Illumina. Resultados: Se realizó la estandarización de un panel para secuenciación dirigida por Oxford Nanopore que comprende 24 genes asociados con farmacorresistencia en TB e involucra más de mil mutaciones, para todos los medicamentos usados en el tratamiento, incluidos los de primera línea y los de los grupos A, B y C de la OMS. El panel tuvo un desempeño comparado con la prueba fenotípica así, en concordancia para la identificación de mutaciones asociadas a resistencia del 89% con las mejores fuerzas de concordancia en la identificación de mutaciones asociadas a resistencia para Clofazimina y Bedaquilina con índices Kappa de 0.78 y 0.79 respectivamente. La sensibilidad se ubicó entre el 58 y el 80% y la especificidad entre el 82 y el 100%. Al comparar el desempeño del panel estandarizado con la secuenciación de genoma completo por Illumina, la concordancia fue del 94% con una alta fuerza de concordancia para Rifampicina, Linezolid, Bedaquilina y Clofazimina, con índices Kappa de 1 para cada antibiótico respectivamente. La sensibilidad se presentó del 67 al 100% y la especificidad del 85 al 100%. Se presentaron resultados no concordantes con una frecuencia del 8.3% entre el panel de secuenciación y los resultados fenotípicos indicando la posible presencia de mecanismos de resistencia intrínsecos que no son detectados por metodologías moleculares. Conclusión: el panel estandarizado tiene un buen desempeño y concordancia para identificar las mutaciones asociadas a todos los fármacos utilizados para el tratamiento de la TB en Colombia, superando las limitaciones de las pruebas fenotípicas y permitiendo al Laboratorio Nacional de Referencia de Colombia en el Instituto Nacional de Salud disponer de nuevas herramientas con tecnología de punta para la vigilancia de la farmacorresistencia con miras al mejoramiento de la salud pública. (Texto tomado de la fuente).

Introduction: Tuberculosis continues to be a major global public health problem. Despite being a preventable and curable disease, by 2023, it had become the leading cause of death worldwide caused by a single infectious agent, surpassing COVID-19. The World Health Organization (WHO) reported 400,000 cases of rifampicin-resistant (RR) and multidrug-resistant tuberculosis (RR/MDR-TB), with a notable increase in the Americas and Southeast Asia. In the Americas, it is estimated that up to 15,000 cases of RR/MDR-TB occur annually; However, only 61% of new cases and 68% of previously treated cases have access to rifampicin susceptibility testing, and less than 20% have access to fluoroquinolone susceptibility testing, despite existing surveillance systems that use drug susceptibility testing using PCR-based phenotypic and genotypic methods, which present limitations in terms of massification, implementation, and response times. Colombia is among the ten countries in the Americas with the highest number of reported cases of RR/MDR-TB. In 2022, the National Institute of Health (INS) reported that of 17,595 identified tuberculosis cases, 473 (2.7%) were drug-resistant TB, representing a 33% increase compared to 2021. Objective: To evaluate a targeted next-generation sequencing panel using Oxford Nanopore for the diagnosis of drug-resistant tuberculosis in Colombia, as a complementary method to drug resistance surveillance. Methodology: An experimental study was conducted to design and standardize a next-generation sequencing panel using Oxford Nanopore technology for determining susceptibility to drugs used for the treatment of sensitive and drug-resistant TB in Colombia. The panel was compared with reference methods for TB susceptibility testing (liquid-based phenotypic testing) and for genome sequencing using Illumina technology. Results: An Oxford Nanopore-directed sequencing panel comprising 24 genes associated with drug resistance in TB and involving more than a thousand mutations was standardized for all drugs used in treatment, including first-line drugs and those in WHO groups A, B, and C. The panel performed well compared to the phenotypic test, achieving 89% concordance for the identification of resistance-associated mutations, with the highest strengths of concordance for clofazimine and bedaquiline, with Kappa indices of 0.78 and 0.79, respectively. Sensitivity ranged from 58% to 80%, and specificity from 82% to 100%. Comparing the performance of the standardized panel with Illumina whole-genome sequencing, concordance was 94%, with high strengths of concordance for rifampin, linezolid, bedaquiline, and clofazimine, with Kappa indices of 1 for each antibiotic, respectively. Sensitivity ranged from 67% to 100%, and specificity from 85% to 100%. Non-concordant results were present, with a frequency of 8.3% between the sequencing panel and the phenotypic results, indicating the possible presence of intrinsic resistance mechanisms not detected by molecular methodologies. Conclusion: The standardized panel has good performance and concordance in identifying mutations associated with all drugs used for TB treatment in Colombia, overcoming the limitations of phenotypic testing and allowing the Colombian National Reference Laboratory at the National Institute of Health to have new, cutting-edge tools for drug resistance surveillance, thus improving public health.