Estandarización de la técnica de amplificación del gen citocromo b, para identificar la fuente de alimento de cx quinquefasciatus en el centro agropecuario Marengo de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá

Abstract

Introducción. Un elemento importante para la incriminación de un insecto como vector, es la identificación de su fuente de alimento con el propósito de saber si es mamofílico, ornitofílico o antropofílico . Culex quinquefasciatus fue escogido porque es una especie de importancia médica y veterinaria, y existen sitios de reposo para ella, en la sabana de Bogotá. En Colombia, pocos son los estudios donde se use la PCR como una herramienta molecular para identificar fuente de alimento en insectos hematófagos. Objetivo: estandarizar las condiciones de amplificación por PCR, del gen Cytb a partir de abdómenes de hembras de Culex quinquefasciatus. Metodología. Primera fase: Se estandarizaron las condiciones de mezcla de PCR para amplificar el gen Cytb. Se probaron tres pares de primers para amplificar regiones del gen mitocondrial Cytb de vertebrados, de mamíferos y de aves. Segunda fase: consistió en hallar el tiempo máximo después de la ingesta de sangre, en que pueden ser amplificadas regiones del gen Cytb de la fuente sanguínea. Para ello, se realizaron ensayos en laboratorio con fuente de alimento conocida utilizando sangre de Gallus gallus y Mus musculus. Tercera fase: fue la validación de la metodología con insectos capturados en campo. Se amplificaron regiones del gen Cytb y posteriormente se secuenciaron para identificar hasta especie, las fuentes de alimento de los insectos recolectados en condiciones naturales. Resultados. Primera fase: Se modificó la concentración de dNTPs de 2 mM a 0,2 mM; se redujeron las unidades de Taq DNA polimerasa de 5 a 2,5 U. Segunda fase: El tiempo máximo de detección de la fuente de alimento fue de 14 días con los primers para vertebrados. Tercera fase: Se logró establecer que Cx quinquefasciatus en Marengo se alimentó preferencialmente de Gallus gallus en un (50%), seguido por Sus scrofa en porquerizas (34%); también se amplificaron regiones de Cytb para Bos taurus (7%), Homo sapiens (7%) y Hemidactylus spp (2%). Mientras que en el campus universitario, se encontró que el 100% estaban alimentadas con aves Turdus fuscater (54.54%) y Columba livia (45.46%). Conclusión: Se logró estandarizar la técnica de amplificación y reproducir tanto en insectos de laboratorio como en insectos de campo. El tiempo límite de amplificación de la región Cytb en vertebrados fue mayor a lo reportado en la literatura (200 h). Fue posible validar los parámetros estandarizados en insectos de campo incluso a partir de abdómenes vacíos. Por último, esta metodología es valiosa y aplicable no solo para Cx quinquefasciatus sino en general para cualquier insecto hematófago recolectado en campo. / Abstract. Introduction. An important aspect in incrimination vectorial of insects is a properly identification of source of food with the aim to determine host preferences as mamophily, ornitophily or antropophily. The model chosen in this study was Cx quinquefasciatus because besides it is related to the transmission of etiologic agents of diseases of public health importance, in some areas of the savannah of Bogota, are known to their resting places.In Colombia, despite the great advances in methodologies for characterizing transmission cycles of tropical diseases, there are few studies in which PCR is used as a molecular tool to identify food sources of blood-sucking insects. Objective: To standardize the conditions of PCR amplification of the Cytb gene from abdomens of females of Culex quinquefasciatus. Methodology. Phase I: standardization of the conditions of the PCR mix to amplify the Cytb gene. Three pairs of primers were tested to amplify regions of this gene in vertebrates, mammals and birds. Phase II: was to find the maximum number of days after the blood meal that can be amplified Cytb gene regions from blood source. To do this, controlled trials were conducted in laboratory to test the standardized conditions, with known food source blood Gallus gallus and Mus musculus, and monitoring of insect feeding was performed. Phase III: was the validation of this methodology with captured insects in the field. Cytb gene regions were amplified and subsequently sequenced to identify species in the blood-meal source of insects collected in natural conditions. Results. Phase I: was modified dNTPs concentration of 2 mM to 0.2 mM and was reduced the units of Taq DNA polymerase from 5 to 2.5 U. Phase II: with the primers for vertebrates, the maximum time for detecting the source of food was 14 days. Phase III: It was established that Cx quinquefasciatus in Marengo preferentially fed on Gallus gallus (50%), followed by Sus scrofa in piggeries (34%); also were amplified Cytb regions for Bos taurus (7%), Homo sapiens (7%) and Hemidactylus spp (2%). While on campus of National University, it was found that 100% fed birds were Turdus fuscater (54.54%) and Columba livia (45.46%).Conclusion: It was possible to standardize the amplification technique and apply it in both laboratory and field insects. The time limit of Cytb amplification of the region in vertebrates was higher than that reported in the literature (200 h). It was possible to validate the standardized parameters of field insects even from empty abdomens. Finally, this methodology is valuable and applicable not only for Cx quinquefasciatus but in general for any blood-sucking insect collected in the field