Análisis de elementos de la maquinaria de deubiquitinación en trofozoitos de Giardia intestinalis

Abstract

En Giardia intestinalis se han identificado diferentes componentes de la ruta de ubiquitinación. Mediante la utilización de herramientas bioinformáticas y algunos ensayos experimentales se han identificado secuencias candidatas a enzimas deubiquitinadoras (DUBs) en el parástio, se cree que estas enzimas son importantes para la regulación de conjugados ubiquitina-proteína in vivo. En este trabajo seleccionamos dos DUBs, UBP6 y RPN11, para ser sobre-expresadas y silenciadas en trofozoitos de la cepa G1 mediante la utilización de un vector específico para Giardia (pTubHApac). Confirmamos la sobre-expresión de las enzimas mediante la inmunodetección del tag de hemaglutinina (HA) y el silenciamiento mediante ensayos de RT-PCR y qRT-PCR. A partir de los parásitos donde se estaban sobre-expresando las proteínas se pudo determinar por ensayos de inmunofluorescencia la localización de las mismas, se encontró que ambas proteínas se ubican en el citoplasma pero Rpn11 se distribuye en aparentes agregados citoplasmáticos. Los ensayos de RT-PCR mostraron que los parásitos silvestres poseen transcritos anti-sentido que creemos pueden ser importantes para la regulación de las enzimas en el parásito. En los parásitos silenciados para Ubp6 se observó un silenciamiento de alrededor del 24% con respecto a los parásitos silvestres, mientras que en los parásitos silenciados para Rpn11 el silenciamiento fue del 61%. A partir de todas las transfecciones se obtuvieron trofozoitos viables que no mostraron diferencias significativas en el crecimiento con respeto a los parásitos silvestres a lo largo del tiempo, aunque si presentaron cambios morfológicos. De este trabajo pudimos concluir que ambos genes se están transcribiendo durante el estadio vegetativo del parásito, por lo cual se puede pensar que son importantes para la homeostasis de ubiquitina en el parásito. Para Rpn11 los ensayos de sobre-expresión y silenciamiento son las primeras pruebas de la existencia de metaloenzimas de la familia JAMM en G. intestinalis / Abstract. Several key components of the ubiquitination pathways are known for Giardia intestinalis. Using bioinformatic tools and experimental procedures have been already identified some candidates sequences coding for deubiquitinating enzymes (DUBs) in this parasite; it is though DUBs are relevant for the actual regulation of conjugates ubiquitine-protein during life cycle in vivo. In the present study we selected two DUBs named Ubp6 y Rpn11 for overexpressing and silencing at trophozoites of the G1 strain through the transfection of the vector pTubHApac specific for Giardia. Overexpressed enzymes were confirmed by inmuno-detection of the hemaglutinine tag (HA) while silencing were tested under RT-PCR and qRT-PCR assays. In those parasites showing overexpression it was determined by means of inmuno-luminescence assays that both DUBs enzymes were located in the cytoplasm, although Rpn11 was revealed apparently forming aggregates. The RT-PCR assays in the non-transfected wild parasites showed ARN-antisense transcripts which we deem could have enzymatic regulatory importance. Ubp6 silencing was around 24% compared to expression in wild parasites while Rpn11 silencing reached 61%. All in all, transfections did not affect the viability or growth of trophozoites throughout time compared with wild ones, although some morphological changes were observed. We tested both genes being transcripted along the vegetative life stage of the parasite which make us conclude these are important to keep ubiquitine homeostasis. Rpn11 overexpession-silencing assays are also one of the first experimental proofs of the existence of JAMM type metollo-enzymes existence in G. intestinalis.