Análisis de determinantes genéticos de virulencia en cepas del virus dengue tipo 2

Abstract

El virus dengue (DENV) es el agente etiológico del dengue, una de las enfermedades más importantes transmitidas por vector y es según la Organización Mundial de la Salud (OMS). Anualmente DENV afecta 50 - 200 millones de personas en el mundo y en Colombia se estima que casi 24 millones son susceptibles a la infección con el virus. Durante el periodo 2013 – 2015 se notificaron 669,631 casos de dengue en el país. Clínicamente, la enfermedad se clasifica como dengue (con y sin signos de alarma) y dengue grave el cual puede ser fatal. Aunque el principal factor asociado a la severidad es la ocurrencia de infecciones secundarias por serotipos heterólogos llevando a una potenciación mediada por anticuerpos, un número creciente de estudios sugiere la existencia de determinantes genéticos de virulencia en diferentes regiones del genoma viral y asociados a la severidad de la enfermedad. El objetivo fue identificar potenciales determinantes genéticos de virulencia asociados en cambios fenotípicos in vitro en cepas de DENV-2 y en el desarrollo de los diferentes cuadros clínicos de la enfermedad. La estrategia metodológica desarrollada en esta investigación incluyó selección de muestras de suero serotipificadas como DENV-2 y de pacientes con dengue y dengue grave. Posteriormente, se realizó aislamiento viral, amplificación y secuenciación del gen de la envoltura y de la región 5’ UTR. Por medio de alineamiento de secuencias y análisis filogenético se determinó el genotipo viral y las relaciones evolutivas entre cepas. Se identificaron estructuras secundarias conservadas de ARN mediante el análisis in silico. Finalmente fueron observadas infecciones in vitro por medio de curvas de crecimiento a diferentes tiempos post-infección y tituladas mediante ensayos de placa. Todas las cepas analizadas pertenecen al genotipo Asiático/Americano y se ubicaron en dos linajes genéticos. Las mismas estructuras secundarias conservadas estuvieron presentes en todas las cepas. En las regiones genómicas analizadas no se identificaron potenciales determinantes genéticos de virulencia y la caracterización in vitro no revela que existan diferencias significativas entre las cepas asociadas a los diferentes cuadros clínicos. Se concluye que no es posible establecer ninguna asociación entre determinantes genéticos de virulencia con las características in vitro de las cepas, ni con los distintos cuadros clínicos de la enfermedad, aunque se identifican posibles estructuras secundarias con algún tipo de funcionalidad potencial no conocido hasta el momento.

Abstract. The Dengue Virus (DENV) is the Etiologic Agent of dengue, one of the most important vector-borne diseases, according to the World Health Organization (OMS). Annually the virus affects around 50-200 million people in the world and in Colombia it is estimated that nearly 24 million are susceptible to infection with the virus. During the period 2013 - 2015 669,631 cases of dengue fever were reported in the country. Clinically, the disease can be classified as dengue (with and without warning signs) and severe dengue which can be fatal. Although the main factor associated with the severity is the occurrence of secondary infections by heterologous serotypes leading to antibody-mediated enhancement (ADE), a growing number of studies suggest the existence of genetic determinants of virulence in different regions of the viral genome of DENV, possibly associated with the development of different clinical presentation. The objective of the research was to identify potential determinants of genetic virulence associated with phenotypic changes in vitro in strains of DENV-2 and the development of different clinical presentation of the disease. The methodological strategy developed in this research includes selection of serum samples serotyped as DENV-2 and patients with dengue and severe dengue. Subsequently, viral isolation, amplification and sequencing of the 5'UTR and envelope gene was performed. Through sequence alignment and phylogenetic analysis on viral genotype and the evolutionary relationships among strains it was determined. Conserved RNA secondary structures using in silico analysis identified. We were finally observed in vitro infections through growth curves at different times post-infection and titrated by plaque assays. All the strains tested belong to the Asian/American genotype and were placed into two genetic lineages. The same conserved secondary structures were present in all strains. In the genomic regions analyzed potential genetic determinants of virulence were not identified and in vitro characterization does not reveal any significant differences between strains associated with different clinical presentations. In conclusion, is not possible to establish any association between genetic determinants of virulence with the phenotypic characteristics of the strains, with different clinical presentations of the disease, even though possible secondary structures are identified with some kind of potential functionality not known until now.