Optimización del proceso de producción, purificación y caracterización de una lacasa a partir de un hongo nativo con potencial aplicación en procesos biotecnológicos

Abstract

La producción de enzimas lignolíticas es una propiedad que exhiben algunos organismos como los hongos. Entre ellas las lacasas se destacan como enzimas oxidasas de cobre (E.C. 1.10.3.2) que catalizan la oxidación por un electrón de compuestos fenólicos, aminas aromáticas, y otros sustratos ricos en electrones con la concomitante reducción de O2 a H2O, con una amplia inespecificidad de sustrato que las hace llamativas para diferentes aplicaciones industriales. Este trabajo buscó potenciar la producción de una lacasa seleccionada entre 7 hongos productores evaluados, con miras a su purificación y caracterización. La cepa seleccionada fue el organismo Xylaria sp. (CH003) el cual fue encontrado sobre madera en descomposición en el Parque Natural Chicaque ubicado entre los municipios de Soacha y San Antonio, Cundinamarca, Colombia. La actividad lacasa fue valorada utilizando azino-bis(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfonato (ABTS) en cultivos del hongo llevados a cabo en fermentación sumergida, encontrando una alta actividad (1021±114 U/L). El medio de cultivo fue optimizado mediante el método de un factor a la vez para fuentes de carbono y nitrógeno, un arreglo ortogonal de Taguchi, y el uso de inductores. Los resultados mostraron que el salvado de trigo (50g/L), KNO3 (1,4g/L) y el inductor 2,5-xilidina (1mM) son componentes importantes del medio de cultivo para elevar la actividad enzimática a un valor de 20535±1405 U/L. Una vez optimizado el medio para la producción de lacasas, la enzima fue purificada mediante diafiltración, cromatografía de intercambio aniónico DEAE, y de exclusión por tamaño. Se obtuvo un factor de purificación de 7,45 y un rendimiento de 0,51% y una vez purificada presentó una actividad específica de 388 U/mg. De acuerdo al análisis electroforético 2D se sugiere la presencia de una proteína de ~38KDa, con un pI de 4,9. Por espectrometría de masas se detectó la presencia de los péptidos GPASAPYDEDK y LVNTAIDTMFK que han sido reportados para lacasas. La enzima purificada presentó un rango de pH y temperatura óptima de reacción entre 3-4 y 50-60°C, respectivamente. Sin embargo, se observó una mayor estabilidad a 30 °C durante tres horas de incubación, manteniendo el 97,2% de actividad, y también una alta estabilidad a valores de pH de 6,7 y 8 reteniendo más del 80% de la actividad luego de tres horas. Usando ABTS se determinó una Km de 297μM y una Vmax de 581,4 μM/min a un pH y temperatura de reacción de 4,5 y 22°C. La enzima fue inhibida por el ion Fe2+, pero inducida por el ion Cu2+. Adicionalmente la enzima no fue altamente inhibida por EDTA (1 y 10mM) en donde conservó casi el 80% de su actividad, pero sí fuertemente inhibida por azida de sodio (1 y 10mM), DTT (0,1mM) y KCN (5mM), en donde la actividad se redujo a menos del 5%.

Abstract. The production of ligninolytic enzymes is a property exhibited by certain organisms as fungi. Among these enzymes, laccases are known as multicopper oxidases (E.C. 1.10.3.2) that catalyze oxidation by one electron of phenolic compounds, aromatic amines, and other electron-rich substrates with concomitant reduction of O2 to H2O, with broad substrate non-specificity, which make them appealing for different industrial applications. This work enhanced laccase production from one fungi selected among 7 enzyme producing organisms, in order to purify efficiently the enzyme and characterize it. The selected strain was the organism Xylaria sp. (CH003) which was founded on decaying wood in Natural Park Chicaque located between towns Soacha and San Antonio, Cundinamarca, Colombia. Laccase activity was measured using azino-bis(3- ethylbenzothiazoline)-6-sulfonate (ABTS) in cultures carried out through submerged fermentation, finding a high activity value associated with this strain (1021 ±114 U/L). Culture media was optimized through one-factor-at the time method for different carbon and nitrogen sources, a Taguchi orthogonal design, and use of inductors. Results showed that wheat bran and KNO3 at a concentration 50g/L and 1,4g/L, respectively, besides inductor 2,5-xylidine (1mM) are important components to raise laccase activity to 20535±1405 U/L. Laccase from Xylaria sp. produced with this strategy was purified through diafiltration, anion exchange chromatography (DEAE) and gel filtration. It was obtained a purification factor of 7,45 and a yield of 0,51%, and once purified laccase showed a specific activity of 388 U/mg. According electrophoretic analysis in 2D electrophoresis was suggested an enzyme of ~38 KDa, and pI of 4,9. Mass spectrometry analysis found peptides GPASAPYDEDK and LVNTAIDTMFK previously reported for laccases. The purified enzyme had optimal pH and temperature among 3-4 and 50-60°C, respectively. However it was observed major stability at 30° retaining 97,2% of the activity, and pH values of 6,7 and 8, retaining more than 80% of activity after three hours of incubation. Kinetic parameters as Km and Vmax was determined using ABTS as substrate finding values of 297μM and 581,4 μM/min respectively, at a pH of 4,5 and temperature of 22°C. Enzyme was inhibited by Fe2+ ion, but induced by Cu2+ ion. Additionally enzyme was not inhibited strongly by EDTA (1 and 10mM), since it kept almost 80% of activity, but highly inhibited by sodium azide (1 and 10mM), DTT (0,1mM), and KCN (5mM), where activity was decreased at less than 5%.